Biochips und ihr Einsatz in der Lebensmittelanalytik - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 55

det an bereits gebundene Antigene und der jeweilige Spot kann sichtbar gemacht
werden. Auch eine zweistufige Detektion ist möglich (nicht gezeigt). Beim Anti-
gen-Microarray werden die einzelnen Proteinantigene gespottet. Diese Arrays sind
wesentlich schwieriger herzustellen, da die zu spottenden Proteine im Gegensatz
zu Antikörpern in der Regel sehr unterschiedliche Eigenschaften aufweisen, was
eine gemeinsame Handhabung problematisch macht. Es wird mit einer Antikör-
per enthaltenden Lösung (z. B. Blutserum) inkubiert. Gegen das jeweilige Antigen
gerichtete primäre Antikörper haften spezifisch an die jeweiligen Spots. In einem
zweiten Schritt werden diese Antikörper durch einen gegen den Antikörpertypus 1
gerichteten sekundären Antikörper nachgewiesen.
Neben den Antikörper-/Antigen-Arrays gibt es auch die reverse Form der Anti-
körper-Arrays, sogenannte Proteinlysat-Microarrays. Gesamtproteinlysate werden
in Spots aufgebracht und es wird mittels Antikörpern überprüft, ob sich bestimm-
te Antigene im Lysat befinden. Auch aktive Proteine wie beispielsweise Enzyme
können in einem Microarray aufgebracht werden. Hier kann die Umsetzung der
Substrate zum Nachweis genutzt werden.

5.1.7 Marker

Als Markierungsreagenzien kommen in der Regel Moleküle zum Einsatz, die an
einen der Reaktionspartner gekoppelt werden. Oft ist dies Biotin, aber auch andere
nichtfluoreszierende Moleküle wie Digoxigenin werden eingesetzt.
Am weitesten verbreitet sind jedoch die biochemischen oder chemischen Mar-
kierungen mit Fluorochromen.

Markierungstechniken Die Markierung der Probennukleinsäuren bzw. -proteine
erfolgt in der Regel direkt mittels enzymatischem Einbau (Nukleinsäuren) oder
indirekt durch eine sekundäre Markierung (Proteine und Nukleinsäuren) bzw. einer
Mischform beider Verfahren (Nukleinsäuren). Die sogenannte direkte Markierung
nutzt die Tatsache, dass DNA-/RNA-Polymerasen modifizierte Bausteine in neu
synthetisierte Nukleinsäurestränge einbauen, die im Anschluss nachweisbar sind.
Alternativ können beim Direkteinbau die modifizierten Bausteine aus reaktiven
Gruppen (in der Regel Amino-Allyl-(d)UTP) bestehen, die erst in einer zweiten,
nachgeschalteten spezifischen chemischen Reaktion (in der Regel monoreaktive
NHS-Ester von Fluoreszenzfarbstoffen) mit den nachweisbaren Molekülen ver-
bunden werden. Diese zweite Variante hat den Vorteil, dass vor einer kompetitiven
Hybridisierung während der ersten, biochemischen Stufe in beide zu vergleichende
Probennukleinsäuren gleiche modifizierte Bausteine eingebaut werden und erst
in der zweiten chemischen Stufe die unterschiedlichen Farben/Marker gekoppelt
werden. Die Verwendung gleicher modifizierter Nukleotide in der ersten biochemi-
schen Reaktion sorgt für gleiche Einbauraten. Im Gegensatz hierzu werden unter-
schiedlich modifizierte Nukleotide vom Enzym unterschiedlich akzeptiert, was zu
einem ungleichen Einbauverhältnis führt.