Biochips und ihr Einsatz in der Lebensmittelanalytik - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 56

Bei der rein sekundären Markierung werden die Marker an die Probennuklein-
säuren (bzw. Kopien der Nukleinsäuren) oder -proteine gekoppelt. Beispiele hier-
für sind z. B. Psoralen-Biotin (Ambion), das „Universal Linkage System“ (ULS)
(Kreatech) oder CyDye™ Reactive Dye (GE-Healthcare).

Detektion Marker können in einer Nachweisreaktion durch Streptavidin bzw.
monoklonale Antikörper gebunden werden, die wiederum an ein Enzym (z. B.
Peroxidase oder alkalische Phosphatase) gekoppelt sind. Das Enzym katalysiert
beispielsweise eine Farbreaktion. Auch eine chemische Farbumsetzung (z. B. Sil-
berfärbung) ist möglich. Gravierender Nachteil all dieser Färbeverfahren ist, dass
die zeit- und aktivitätsabhängige Farbumsetzung keine sichere quantitative Aus-
sage erlaubt. Alternativ kann die Sichtbarmachung auch über Fluoreszenz erfolgen.
Fluoreszenz muss zwar in einem geeigneten Lesegerät sichtbar gemacht werden
(s. unten), aber die Markierung ist sehr sensitiv und im Gegensatz zu den enzymba-
sierten Technologien sehr gut quantifizierbar.

5.1.8 Messprinzipien/Lesegräte

Auf Färbung basierende Microarray-Assays werden mit angepassten handelsüb-
lichen Scannern ausgelesen (z. B. http://www.chipron.com; http://www.clondiag.
com; http://www.eppendorf.com.
Fluoreszenz kann entweder über Laserscanner oder über Bildgewinnung (CCD/
CMOS-Sensoren) gemessen werden. Laserscanner (z. B. http://www.axon.com;
http://www.agilent.com) rastern den Träger ab und setzen die pro Rasterpunkt ge-
messene Fluoreszenz in ein Bild um. Da die Messzeiten pro Bildpunkt sehr kurz
sind, muss mit hoher Energie bestrahlt werden, was ein schnelles Ausbleichen der
Fluorochrome zur Folge hat. Es können zudem nur Fluorochrome verwendet wer-
den, die im Wellenlängenbereich der vorhandenen Laser angeregt werden. Vorteile
sind die gleichmäßige Auslesung beliebig großer Trägerflächen. In der Sonderform
der konfokalen Anordnung sind optische Schnitte möglich. Ähnliches wird über die
sogenannte „totale interne Reflexion“ (TIR) erreicht (z. B. http://www.zeptosens.
com), bei der der Laser, ähnlich wie bei einem Glasfaserlichtleiter, an der Unter-
seite der Chipoberfläche vollständig reflektiert wird und daher nur im Spot (an der
Oberfläche) befindliche Fluorochrome anregt. Beide Techniken ermöglichen ein
Livebild während der Hybridisierung.
CCD/CMOS-kamerabasierte Lesegeräte arbeiten meist mit einer Weißlichtquel-
le (LED, Halogen) sowie Filtern für Extinktion und Emission (z. B: http://www.api.
com/lifescience/arrayworx.html;http://www.lavisionbiotec.de/start_product_index.
html; http://www.Genewave.com; http://www.ditabis.de). Vorteile sind die Ver-
wendung verschiedenster Fluorochrome mit entsprechenden Filtern, ein geringes
Ausbleichen der Fluorochrome und die Aufnahme unterschiedlicher Farben ohne
das Bild abzurastern, was eine Bildverschiebung der unterschiedlichen Kanäle ver-
meidet. Ein Nachteil kann die begrenzte Bildgröße bedeuten, die nicht den ganzen