PCR und Real-Time PCR - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 45

Extraktion enthalten sind, die die Effektivität der PCR stark herabsetzen, sodass
kein Amplifikat mehr entsteht. Durch Zugabe von Inhibitionskontrollen in jeden
PCR-Ansatz wird sichergestellt, dass Inhibitoren erkannt werden. Dies wird auch
von dem europäischen Standardisierungskomitee (CEN) und der International
Standardization Organization (ISO) in einer allgemeinen Richtlinie für PCR-Tests
im Lebensmittelbereich gefordert (EN ISO 22174). Das Design der internen Am-
plifikationskontrollen (IAC) bleibt aber offen. Bei der kompetetiven IAC wird ein
artifizielles DNA-target mit den gleichen Primern amplifiziert wie die Ziel-DNA,
um zu gewährleisten, dass die PCR-Kinetiken von IAC und target vergleichbar
sind [ 21 ]. Die IAC-Konzentration muss aber sorgfältig eingestellt werden, denn
ein Zuwenig an IAC begünstigt evtl. zu stark die Zielreaktion, während zuviel IAC
evtl. Inhibitoren nicht anzeigen und mit der Ziel-DNA zu stark konkurrieren würde.
Deshalb sollte auch die IAC ein längeres Amplifikat ergeben als das target [ 21 ]. Als
Inhibitionskontrolle kann z. B. eine Fremd-DNA (als linearisierte Plasmid-DNA)
zugegeben werden, die unabhängig von der Ziel-DNA in einer zweiten PCR-Re-
aktion amplifiziert wird (nichtkompetetive IAC). Der Nachteil dieser Form der IAC
ist, dass aufgrund der unterschiedlichen Primer-Paare die Amplifikation von IAC
und target nicht hundertprozentig vergleichbar ist. Die Konzentrationen der Fremd-
DNA und Primern sollten deshalb möglichst niedrig gehalten werden und Größe
und Nukleotidzusammensetzung sorgfältig gewählt werden [ 21 ]. Ein Beispiel für
eine Inhibitionskontrolle ist ein kloniertes Fragment der Methyltransferase aus Ta-
bak (ntb2), das mit entsprechenden Primern und Sonden amplifiziert bzw. detektiert
wird [ 22 ].
Wird die Ziel-DNA amplifiziert, die IAC aber nicht, so gilt die Probe trotzdem als
positiv. Dies ist der Fall, wenn die Ziel-DNA in sehr großen Mengen vorliegt. Nur
wenn weder die Ziel-DNA noch die IAC amplifiziert werden, muss von Inhibitoren
im PCR-Ansatz ausgegangen werden und die PCR wiederholt werden. Oft genügt
es, die Proben-DNA 1:10 oder 1:100 zu verdünnen; wenn dies nicht zum Erfolg
führt, muss die Extraktionsmethode überdacht werden, um störende Substanzen zu
entfernen. Gerade in der Lebensmittelanalytik sind diese sogenannten Matrixeffek-
te ein häufiges Problem und erschweren den Direktnachweis von z. B. Pathogenen
oder von GVOs aus einer Vielzahl von Lebensmitteln (z. B. Schokolade).
Mithilfe der IAC werden zwar Inhibitoren in der PCR-Reaktion erkannt, sie
gibt aber keine Auskunft darüber, ob überhaupt genügend Proben-DNA in entspre-
chender Qualität extrahiert wurde. Die Effektivität der DNA/RNA-Extraktion und
-Amplifikation kann auf verschiedenen Wegen überwacht werden. Es wird entwe-
der ein Referenzpräparat (z. B. eine Reinkultur des jeweiligen Pathogens oder der
Zielsequenz) parallel zu den unbekannten Proben extrahiert oder man führt eine
zusätzliche PCR-Reaktion durch, die z. B. die Proben-DNA nachweist (z. B. So-
jalectin bei Untersuchungen von Sojaprodukten auf GVOs) oder ribosomale Gene
beim Nachweis von bakteriellen Pathogenen. Es kann aber auch zu Beginn jeder
Probe DNA/RNA zugesetzt werden, welche dann in der PCR nachgewiesen wird
und gleichzeitig eine Inhibitionskontrolle darstellt. Beim Nachweis von RNA-Viren
wird diese Strategie gerne verfolgt, um RNAse-Aktivität auszuschließen und die
reverse Transkription zu überprüfen [ 23 ].