PCR und Real-Time PCR - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 44

nen Sonde arbeiten (Taqman, Lightcyler, Molecular Beacons etc.) benötigen keine
weitere Bestätigung, da durch die Sonde die Spezifität zusätzlich erhöht wird. Eine
ausreichende Validierung des Systems wird dadurch aber keinesfalls ersetzt.
In der Lebensmittelanalytik kann zudem die Isolierung der pathogenen Keime
gefordert werden, um die Lebensfähigkeit der Erreger zu zeigen.

4.6 Qualitätssicherung im PCR-Labor und Kontrollen

Voraussetzung für die Anwendung von PCR-Techniken in der Routineanalytik ist
die Definition und Einhaltung bestimmter Qualitätsstandards, um vergleichbare
Ergebnisse zwischen einzelnen Untersuchungslaboren zu gewährleisten [ 19 ]. Gre-
mien, die solche Qualitätsstandards erarbeiten und in Normen festschreiben, sind
auf nationaler Ebene das Deutsche Institut für Normung e. V. (DIN), auf europäi-
scher Ebene das European Committee for Standardization (CEN) und weltweit die
International Organization for Standardization (ISO). Eine Recherche auf den Sei-
ten der DIN (www.din.de) unter den Stichworten Nukleinsäure und Lebensmittel
liefert 81 Regelwerke, die sich mit den allgemeinen Anforderungen an PCR-Nach-
weise und Extraktionsverfahren beschäftigen und bis hin zu spezifischen Nachwei-
sen bestimmter Pathogene, Allergene oder GVOs reichen. Weitere Richtlinien für
Nukleinsäureamplifikationstechniken werden von der Deutschen Gesellschaft für
Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) für die mikrobiologische Diagnostik heraus-
gegeben (MiQ) [ 20 ].
Die größte Herausforderung bei der Anwendung von PCR-Techniken ist die Ver-
meidung von Kontaminationen, um keine falsch-positiven Ergebnisse zu produzie-
ren. Eine wichtige Maßnahme ist die räumliche Trennung von Probenaufarbeitung
(Prä-PCR-Bereich), Handhabung der Reagenzien (Master-Mix) und Amplifikation
und Nachweis der Nukleinsäuren (Post-PCR-Bereich) [ 19 ]. Eine Verschleppung von
PCR-Produkten zurück in den Master-Mix-Bereich oder die Probenaufarbeitung ist
durch z. B. jeweils eigene Geräte und Pipetten und Wechsel der Schutzkleidung
unbedingt zu verhindern. Pipettenspitzen mit Aerosolschutz und für die PCR ge-
eignete sterile, nukleasefreie Gefäße sind Standard in einem molekularbiologischen
Labor. Eine regelmäßige Dekontamination und Bestrahlung der Arbeitsflächen mit
UV-Licht ist durchzuführen.
Die Verwendung von Uracil-N-Glycosylase bei der DNA-PCR ermöglicht den
Abbau von verschleppten PCR-Amplifikaten im PCR-Ansatz, wenn von Anfang an
dUTPs bei der PCR-Reaktion verwendet wurden.
Real Time-PCR-Techniken haben den großen Vorteil, dass nach Ablauf der Re-
aktion die Gefäße nicht mehr geöffnet werden müssen und somit eine wichtige
Kontaminationsursache ausgeschlossen wird.
Um mögliche Kontaminationen frühzeitig zu erkennen, werden Negativkon-
trollen sowohl bei der Probenextraktion als auch der PCR-Reaktion („no template
control“ oder Master-Mixkontrolle) mitgeführt. Falsch-negative Ergebnisse kön-
nen entstehen, wenn im Reaktionsansatz inhibierende Substanzen z. B. aus der