PCR und Real-Time PCR - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 43

4.4 Optimierung und Validierung

Jede PCR-Methode, gleich ob konventionelle PCR oder real-time PCR, muss bei
Einführung ins Routinelabor zuerst optimiert und an die verwendeten Reagenzien
und PCR-Cycler angepasst werden. Meist genügt es, die Annealing-Temperatur um
einige Grad herauf- oder herabzusetzen, um die Spezifität der Reaktion zu erhöhen
bzw. zu senken. Ein Gradientencycler ermöglicht es, die optimale Annealing-Tem-
peratur in einem Lauf über einen breiten Bereich zu ermitteln. Für die Optimie-
rung einer PCR-Reaktion sollten immer die Konzentrationen von Nukleotiden und
MgCl 2 aufeinander abgestimmt werden. Für den Master-Mix werden in der Regel
40-200 µM Nukleotide (dNTPs) eingesetzt und die MgCl 2 -Konzentration sollte
zwischen 1 und 4 µM liegen. Eine zu hohe Konzentration von dNTPs kann die PCR
inhibieren. Die optimale MgCl 2 -Konzentration sollte in jedem Falle titriert werden,
denn die Mg 2+ -Ionen bilden mit den eingesetzten Nukleotiden Komplexe, die dann
für die Funktion als Coenzym für die Polymerase nicht mehr zu Verfügung stehen.
Ein weiteres wesentliches Kriterium ist die Reinheit der isolierten DNA; die Entfer-
nung möglicher Inhibitoren gelingt am besten durch die Aufreinigung mit zusätz-
lichen Säulchen. Auch die Menge an eingesetzter DNA hat einen entscheidenden
Einfluss auf das Ergebnis: zu viel DNA inhibiert die Reaktion. Gegebenenfalls ist
die eingesetzte DNA-Menge zu verdünnen und die Reaktion zu wiederholen. Auch
die Spezifität und Konzentration der eingesetzten Primer sind von zentraler Be-
deutung. Ein mangelhaftes Primer-Design kann die Ausbeute deutlich verringern,
im Zweifelsfall ist es sinnvoller und schneller, sich ähnliche Primer zu designen, als
langwierig alle Reaktionsbedingungen zu optimieren.
Werden kommerzielle PCR-Kits verwendet, fallen diese Optimierungsversuche
meist weg und man richtet sich nach den Angaben der Hersteller.
Worauf aber nicht verzichtet werden kann, ist eine gründliche Validierung der
neuen PCR-Assays bei Einführung in die Routineanalytik. In der Regel wird die
neue Methode zuerst an einer genügend hohen Anzahl von Referenzstämmen auf
ihre Inklusivität und Exklusivität hin überprüft. Danach wird sie anhand von rea-
len Proben mit dem bisherigen „Goldstandard“ verglichen, um die Rate der falsch-
positiven und falsch-negativen Resultate bestimmen zu können. Erst dann kann der
neue (Real Time-)PCR-Assay in die Routineanalytik aufgenommen werden.

4.5 Bestätigungsreaktionen

Die Bestätigung der Ergebnisse der PCR-Analysen kann auf mehreren Wegen er-
folgen. Das genaueste aber auch aufwändigste Verfahren ist die Sequenzierung des
PCR-Fragmentes, um sicherzugehen, dass der gewünschte DNA-Abschnitt verviel-
fältigt wurde. Weitaus einfacher in der Durchführung ist der Verdau der Amplifikate
mit einem Restriktionsenzym; man erhält dadurch für das PCR-Produkt charakte-
ristische Fragmentgrößen. Real Time-Verfahren, die mit einer zusätzlichen inter-