PCR und Real-Time PCR - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 37

eines 500 bp langen Fragmentes [ 1 ]. Eine Weiterentwicklung stellt die „Lab-on-
a-Chip“-Technologie (z. B. Agilent Technologies oder Biorad) dar. Sie kommt mit
geringsten DNA-Mengen aus und kann Fragmente unter 1000 bp bis auf drei Ba-
senpaare unterscheiden. Auf einem Mikrochip wird Polymer mit einem Fluores-
zenzfarbstoff in winzige Kanäle verteilt und Marker und Probe zugegeben. Nach
Anlegen der Spannung durch Eintauchen der Elektroden in die einzelnen Kavitäten
wandern die DNA-Moleküle durch das Polymer am Fluoreszenzdetektor vorbei und
werden aufgezeichnet. Vorteile dieser auf Mikrofluidität basierenden Methode sind
das Wegfallen des giftigen Ethidiumbromids und die genaue und schnelle Analyse
der PCR-Fragmente. Eine der neuesten Weiterentwicklungen auf dem Markt basiert
auf Kapillarelektrophorese, das so arbeitende Gerät kann nacheinander in Reihen
eine 96-Well-Platte abarbeiten (Fa. Qiagen).

4.2.2 Real-Time PCR

Einen Meilenstein in der Entwicklung der PCR-Methodik stellt die real-time PCR
dar, bei der die Amplifikate in Echtzeit detektiert werden und damit sehr viel schnel-
ler die Analysen durchgeführt werden können [ 5 ]. Die real-time PCR bietet enorme
Vorteile durch die verringerte Kontaminationsgefahr; das PCR-Amplifikat muss
nicht mehr auf ein Agarosegel aufgetragen werden (Vermeidung von „carry-over“)
und die Integration der Bestätigungsreaktion erfolgt im PCR-Lauf (fluoreszenzmar-
kierte Hybridisierungssonden).
Aus diesen Gründen hat die real-time PCR konventionelle PCR-Methoden in der
Routineanalytik inzwischen weitgehend abgelöst. Kommerzielle PCR-Detektions-
Kits für die Lebensmittelanalytik werden fast ausschließlich im Real Time-Format
angeboten.
Das zentrale Prinzip der real-time PCR mit Hybridisierungssonden ist der Flu-
oreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET), ein physikalischer Prozess, bei dem
die Energie eines angeregten Fluoreszenzmoleküls (Donor-Fluorophor oder Akzep-
tor-Molekül) strahlungsfrei auf ein zweites Fluoreszenzmolekül (Akzeptor-Fluoro-
phor oder Quencher) übertragen wird, wenn beide sich in räumlicher Nähe befinden
[ 6 ]. Das Reportermolekül wird bei einer definierten Wellenlänge zur Fluoreszenz
angeregt und gibt diese Energie aufgrund seiner räumlichen Nähe zum Quencher
weiter, der diese Energie aufnimmt. Voraussetzung ist, dass sich das Emissions-
spektrum des Donors mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptors überlappt. Wenn
die räumliche Nähe der beiden Moleküle unterbrochen wird, kann die Energie ge-
messen und als ein Maß für die PCR-Reaktion ausgewertet werden.
Die einfachste Methode ist die Zugabe von Farbstoffen, die sich an doppel-
strängige DNA anlagern und in der gebundenen Form Fluoreszenz emittieren. Am
gebräuchlichsten ist SYBR Green, das nach Bindung an die DNA ein 1000fach
erhöhtes Fluoreszenzsignal freisetzt [ 7 ]. In Lösung geht die Emission fast gegen
null. Diese Eigenschaft erlaubt es, die Akkumulation des PCR-Produktes kontinu-
ierlich zu verfolgen. Im Vergleich zu sondenbasierten Methoden ist die Etablierung