PCR und Real-Time PCR - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 36

4.2 PCR-Reaktion und Komponenten

Bei der PCR macht man sich die Fähigkeit des Enzyms DNA-Polymerase zunutze,
einzelsträngige DNA mit den komplementären Nukleotiden zu Doppelsträngen zu
ergänzen. Die Polymerase benötigt zum Start der Synthese ein kurzes Stück dop-
pelsträngige DNA mit einem freien 3′-OH-Ende. Der Reaktionsansatz enthält des-
halb zwei kurze 20-30 Basen lange einzelsträngige Oligonukleotide (Primer), deren
Sequenz komplementär zum Anfang und Ende des zu amplifizierenden DNA-Ab-
schnittes ist. Ein Primer bindet am Sense-Strang, der andere am Gegenstrang („an-
tisense“) bei einer definierten Temperatur (Annealing), die von der Schmelztempe-
ratur der Primer und der Salzkonzentration im Reaktionsansatz abhängig ist [ 2 ].
Durch Erhöhung der Temperatur auf über 95 °C trennen sich die neu gebilde-
ten Doppelstränge (Denaturierung) und stehen wieder als Template zur Verfügung.
Mit jedem Zyklus wiederholt sich der Wechsel aus Denaturierung, Annealing der
Primer und Neusynthese des DNA-Stranges (Extension). Die Menge der PCR-Am-
plifikate verdoppelt sich dabei. Dieser dreistufige Ablauf kann verkürzt werden,
indem Primer-Annealing und Extension in einem Schritt (zumeist bei 72 °C) zu-
sammengefasst werden, was zu einer erheblichen Zeitersparnis führt. Gute DNA-
Polymerasen zeichnen sich durch eine hohe Prozessivität aus, d. h. die Fähigkeit,
bei 72 °C längere DNA-Stücke synthetisieren zu können sowie durch eine hohe
Stabilität bei 95 °C. Die gebräuchlichste Polymerase stammt ursprünglich aus dem
Bakterium Thermus aquaticus und wird als Taq-Polymerase in verschiedenen Va-
rianten angeboten [ 3 ].
Pfu-Polymerase aus Pyrococcus furiosus oder die Pwo-Polymerase aus Pyrococ-
cus woesei besitzen neben der 5′-3′-Polymeraseaktivität eine 3′-5′-Exonukleaseak-
tivität, die falsch eingebaute Nukleotide erkennt und ersetzt (Proof-reading-Aktivi-
tät). Sie werden eingesetzt, wenn eine besonders genaue Amplifikation gewünscht
wird, z. B. um eine Sequenzierung anzuschließen [ 4 ].
Hotstart-Taq-Polymerasen müssen durch einen 5-15 minütigen Denaturierungs-
schritt aktiviert werden, ansonsten sind sie bei niedrigeren Temperaturen inaktiv.
Der PCR-Ansatz kann bei Raumtemperatur pipettiert werden, ohne dass Primer-Di-
mere oder unspezifische PCR-Produkte entstehen. Vorteile bieten sie insbesondere,
wenn komplexe genomische DNA amplifiziert werden soll, die Ziel-DNA nur in
sehr geringen Mengen vorliegt oder mehrere Primer-Paare gleichzeitig verwendet
werden.

4.2.1 PCR

Bei der konventionellen PCR mit Endpunktanalyse werden die Amplifikate durch
Gelelektrophorese der Fragmentlänge nach aufgetrennt und mit Ethidiumbromid
unter UV-Licht sichtbar gemacht. Die Empfindlichkeit der Agarosegelelektropho-
rese mit Ethidiumbromidfärbung beträgt 10 10 Moleküle, das entspricht etwa 5 ng