PCR und Real-Time PCR - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 38

und Optimierung eines SYBR Green Assays relativ schnell und einfach, man be-
nötigt lediglich ein Primer-Paar und optimiert dann die PCR-Effizienz. Nachteil
dieser Form der real-time PCR ist, dass unspezifisch amplifizierte Fragmente oder
Primer-Dimere ebenfalls messbare Signale liefern [ 8 ]. Eine Schmelzkurvenanalyse
hilft, diese unerwünschten Amplifikate zu erkennen. Dabei wird die Temperatur
langsam erhöht, bis sich die DNA-Stränge abhängig von ihrer Länge und Sequenz
trennen. SYBR Green dissoziiert von der DNA und die Fluoreszenz sinkt. Die Fluo-
reszenz wird gegen die Temperatur aufgetragen und es lassen sich anhand der
Schmelztemperatur ( Tm ) spezifische Amplifikate von unspezifischen unterschei-
den. Dieses Analyseformat ist für die Analytik weniger geeignet, da die Schmelz-
kurven nicht als Bestätigungsreaktion für eine PCR anerkannt sind.
Eine höhere Spezifität wird bei Zugabe eines weiteren Oligonukleotides, der in-
ternen Sonde, die innerhalb des PCR-Produktes bindet, erreicht. In Abwesenheit
der Zielsequenz findet keine Hybridisierung der mit einem Fluorophor versehenen
Sonde statt, das Fluoreszenzsignal bleibt unterdrückt (quenching). Erst nach Bin-
dung an die Zielsequenz wird das Quenching aufgehoben, und die Fluoreszenz kann
detektiert werden. Die Menge an Fluoreszenzsignal korreliert direkt mit der Men-
ge an gebildetem PCR-Produkt in jedem PCR-Zyklus. Ein wesentlicher Vorteil im
Vergleich zu DNA-bindenden Farbstoffen ist die Möglichkeit, gleichzeitig mehrere
PCR-Targets unter Verwendung verschieden markierter Sonden zu detektieren.
Weit verbreitet sind TaqMan ® - oder 5′-Nuclease-Assays. Sie wurden zuerst
im Jahr 1991 beschrieben [ 9 ]. Die Oligonukleotid-Sonde trägt am 5′-Ende einen
Reporterfluoreszenzfarbstoff und einen Quencher, der entweder intern oder am
3′-Ende liegen kann. Der in räumlicher Nähe liegende Quencher unterdrückt die
Fluoreszenzemission des Reporters. Erst wenn die Taq-Polymerase mit ihrer 5′-
3′-Exonukleaseaktivität die Taqman-Sonde abbaut, werden Reporter und Quencher
getrennt und die Fluoreszenz freigesetzt.
Molecular Beacons bilden eine Haarnadelstruktur mit zueinander komplementä-
ren Enden, sodass Reporter und Quencher in direkter Nachbarschaft liegen. Solange
die Sonden frei in Lösung sind, wird die Fluoreszenzemission unterdrückt. Erst
wenn sie an die Zielsequenz hybridisieren, ändert sich die Konformation durch die
Auflösung der Haarnadelstruktur und Fluoreszenz wird freigesetzt.
Bei real-time PCR Assays, die mit dem Lightcycler durchgeführt werden, ver-
wendet man oft zwei Hybridisierungssonden, welche an die Zielsequenz zwischen
den Primern im Abstand von 1-5 Basen binden [ 8 ]. Jede der beiden Sonden ist mit
einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert. Nach erfolgreicher Hybridisierung
der beiden Sonden an die Ziel-DNA und Anregung des Farbstoffes (z. B. Fluores-
cein) der Donor-Sonde, überträgt diese die Energie auf den benachbarten zweiten
Fluoreszenzfarbstoff (z. B. LC Red 640) der Akzeptor-Sonde, der dann Fluores-
zenz emittiert (FRET). Die freigesetzte rote Fluoreszenz ist direkt proportional zur
Menge an amplifizierter Ziel-DNA und wird einmal pro Zyklus nach dem Primer-
Annealing gemessen. Ungebundene Sonden, die frei in der Lösung diffundieren,
ergeben aufgrund fehlender räumlicher Nähe zueinander kein Signal.
Formate, die Primer und Sonden in einem Molekül kombinieren, sind Scorpion-
Sonden und Amplifluor Direct ® Primer. Scorpion-Sonden bestehen aus einem Pri-