Extraktion von DNA - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 26

Atomgruppen oder Bindungen adsorbieren Licht unterschiedlicher Wellenlängen.
Bei Nukleinsäuren sind die aromatischen Ringe der vier Basen für die Adsorption
verantwortlich. Für die Bestimmung der Konzentration einer Nukleinsäure (so-
wohl DNA als auch RNA) wird ihr Adsorptionsmaximum bei einer Wellenlänge
von 260 nm in einer Quarzküvette, die selbst kein Licht adsorbiert, gemessen. Eine
Lösung mit 50 µg/ml doppelsträngiger (ds) DNA, 40 µg/ml einzelsträngiger (ss)
DNA, 33 µg/ml RNA oder 20 µg/ml Oligonukleotide besitzen unter definierten Be-
dingungen einen Adsorptionswert, die sog. optische Dichte, von 1.
Um die Qualität einer Nukleinsäure zu messen, wird ihre Adsorption bei 260 nm
und bei 280 nm bestimmt. Ein A 260 /A 280 nm-Quotient von >1,8 ± 0,1 spricht für eine
reine DNA-Isolierung, ein Verhältnis von >2,0 ± 0,1 für eine reine RNA-Isolierung.
Ist die Nukleinsäurelösung mit Proteinen oder Phenol kontaminiert, so beträgt der
A 260 /A 280 nm-Quotient <1,5. Um zu überprüfen, ob die Probe Salze, Peptide oder
Polysaccharide enthält, die eine nachfolgende Applikation beeinflussen können,
wird die Adsorption bei 260 nm und bei 230 nm bestimmt. Beträgt der A 260 /A 230 nm-
Quotient <1,2, so ist davon auszugehen, dass noch organische Komponenten in der
Probe enthalten sind [ 4 , 5 ].
Neuere Spektrophotometer (z. B. NanoDrop [Thermo Scientific], Nano-Photo-
meter [Implen]) benötigen nur noch geringe Mengen (0,7 bis 5 µl) unverdünnter
DNA, sind leicht zu reinigen und benötigen keine Küvetten oder Kapillaren mehr.
Sie stellen eine schnelle und unkomplizierte Alternative zur herkömmlichen Spek-
trophotometrie dar [ 7 , 8 ]. Ein Nachteil der photometrischen Bestimmung ist, dass
doppelsträngige DNA nicht gezielt gemessen werden kann. So werden in der Probe
vorkommende freie Nukleotide und einzelsträngige Nukleinsäuren mitgemessen.
Folglich kann auch nicht zwischen RNA und DNA unterschieden werden. In der
Probe vorhandene Verunreinigungen durch organische Komponenten führen eben-
so zu falschen Messergebnissen.
Um diese Nachteile zu umgehen, erfolgt die Bestimmung der Nukleinsäurequan-
tität häufig mithilfe von Fluoreszenzfarbstoffen (z. B. PicoGreen, Hoechst 33258),
die gezielt an doppelsträngige DNA binden. Diese adsorbieren Licht bestimmter
Wellenlänge und gehen dadurch in einen angeregten Zustand über, aus dem sie un-
ter Abgabe (Emission) von längerwelliger und damit energieärmerer Lichtstrahlung
zurückfallen. Dieses Phänomen wird als Fluoreszenz bezeichnet. In Lösung besit-
zen die Fluoreszenzfarbstoffe eine schwache Eigenfluoreszenz, sind sie jedoch an
die DNA gebunden, nimmt die Fluoreszenz zu und es kommt zu einer Verschiebung
des Emissionsmaximums. Die Zunahme der Fluoreszenz wird mit einem Fluorome-
ter bestimmt und die DNA-Konzentration anhand einer Eichkurve ermittelt.
Die Bestimmung der Nukleinsäurequantität mittels Fluoreszenzfarbstoffen bie-
tet den Vorteil, dass gezielt doppelsträngige DNA gemessen werden kann und das
Messergebnis nicht durch die Anwesenheit von Proteinen verfälscht wird.
Die Fluorometrie ist gegenüber der Absorptionsphotometrie wesentlich emp-
findlicher und eignet sich daher für sehr kleine DNA-Mengen [ 9 , 10 ].
Sehr geringe DNA-Mengen lassen sich auch mithilfe einer Agarosegelelektro-
phorese in Bezug auf einen Standard (Verdünnungsreihe bekannter Konzentratio-