Extraktion von DNA - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 25

werden. Durch Zugabe von 1,2 M NaCl wird die DNA in Lösung gebracht und
anschließend mithilfe von Ethanol gefällt.
Bei einer NaCl-Konzentration von >0,6 M werden durch CTAB Proteine kom-
plexiert. CTAB bildet unter diesen Umständen Komplexe mit Proteinen, Polysac-
chariden und sekundären Inhaltsstoffen. Zum Entfernen der CTAB-Protein- und
CTAB-Polysaccharidkomplexe und überschüssigem CTAB wird eine Chloroform/
Isoamylalkohol-Extraktion durchgeführt. Nach Zentrifugation bleibt die DNA in
der wässrigen Phase. Diese wird abgenommen und zum Entfernen von RNA mit
RNAse A versetzt. Nach Zugabe von Isopropanol fällt die DNA als fädige Struktur
aus. Durch Waschen mit Ethanol werden Salze entfernt. Ethanolreste werden durch
verdampfen entfernt. Dieser Vorgang kann durch eine Vakuumzentrifuge beschleu-
nigt werden [4] .
Bei der DNA-Extraktion aus Lebensmitteln hat sich herausgestellt, dass nach
Durchführung der beschriebenen Methode in der gelösten DNA immer noch Inhibi-
toren vorhanden sind. Deshalb wird im Anschluss eine erneute Reinigung über eine
kommerziell erhältliche Silica-Säule empfohlen.
Häufig erfüllen traditionelle Methoden wie die detergenzvermittelte Lyse mit
anschließender Proteinase-K-Behandlung und Phenol/Chloroform-Extraktion
nicht die Anforderungen, die für eine Durchführung in einem Routinelabor er-
forderlich sind. Sie sind für eine DNA-Isolierung aus großen Zellzahlen und Volu-
mina konzipiert und werden heute hauptsächlich in Forschungslaboren eingesetzt.
Sie bedeuten einen hohen Arbeits- und Zeitaufwand, der in einem Routinelabor
unerwünscht ist. Die Phenol/Chloroform-Extraktion z. B. liefert zwar sehr reine
DNA, ist jedoch sehr zeitintensiv, da sie eine große Anzahl an Arbeitsschritten und
auch Materialien erfordert. Auch der Umgang mit organischen Lösungsmitteln,
die gesondert entsorgt werden müssen, ist in der Routine nicht erwünscht. Durch
die vielen Arbeitsschritte, die auch viele Reaktionsgefäßwechsel beinhalten, ist
die Methode auch sehr anfällig für Kontaminationen und nicht für eine Automa-
tisierung geeignet. Zu den weiteren Nachteilen zählt, dass kleine Volumina nicht
extrahiert werden können und dass die isolierten Nukleinsäuren sehr lang sind und
dies für einige Folgereaktionen, wie z. B. die enzymatische Amplifikation, von
Nachteil ist.
Deshalb haben sich neben diesen klassischen Methoden die beschriebenen chro-
matographischen Reinigungsstrategien etabliert, die in der Routine in Form von
kommerziell erhältlichen Kits eingesetzt werden. Die meisten Kits basieren auf
„Spin Colums“. Der Vorteil der Kits ist, dass sie vom Zellaufschluss bis hin zur
Lösung des Pellets alle erforderlichen Reagenzien enthalten und die Extraktion in
wenigen Schritten in einem Arbeitsgang durchgeführt werden kann [4] .

3.2.3 Nukleinsäurequantität und Qualität

Die Konzentration (Quantität) einer DNA- oder RNA-Lösung wird im Labor übli-
cherweise photometrisch bestimmt. Einzelne biologische Substanzen bzw. einzelne