Extraktion von DNA - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 23

Durch Chloroform, das ebenfalls denaturierend auf Proteine wirkt, kommt es
zu einer Stabilisierung der Phasengrenze zwischen wässriger Nukleinsäurelösung
und Phenolphase. Isoamylalkohol verhindert ein Schäumen während des Misch-
vorgangs.
Zur Volumenreduktion und weiteren Reinigung der DNA von sonstigen Zell-
komponenten wird die DNA mithilfe von Ethanol und monovalenten Kationen
(z. B. Natriumacetat) gefällt (präzipitiert). Dadurch bildet die DNA einen unlös-
lichen Niederschlag. Durch die Zugabe von Ammoniumacetat kann die Copräzipi-
tation freier Nukleotide reduziert werden.
Soll das Volumen des Fällungsansatzes gering bleiben, wird für die Fällung Iso-
propanol verwendet.
Durch Waschen des Nukleinsäurepellets mit 70 %igem Ethanol können mitge-
fällte Salze größtenteils entfernt werden. Für die Präzipitation von geringen Men-
gen an DNA werden sogenannte Carrier (z. B. tRNA, Glykogen oder lineares Po-
lyacrylamid) eingesetzt, die ebenfalls durch Ethanol präzipitiert werden und die
Nukleinsäure mit ausfällen. Wichtig ist dabei, dass die verwendeten Carrier das
nachfolgende Experiment nicht beeinflussen.
Für die Konzentrierung kleiner Probenvolumina eignet sich ebenfalls eine Vaku-
umkonzentrationszentrifuge (Speed Vac System) [ 4 , 5 ].

3.2.2.2 Gelfiltration

Ein für die Reinigung von DNA, Proteinen und Polysacchariden geeignetes Chro-
matographieverfahren ist die Gelfiltration. Die Methode beruht auf dem Molekular-
siebeffekt der verwendeten Gelfiltrationsmaterialien. Dabei eluieren große DNA-
Moleküle im Ausschlussvolumen des Säulenmaterials, während kleinere Moleküle
(z. B. Nukleotide und andere Verunreinigungen) durch die Poren des Gelfiltrations-
materials diffundieren und später eluieren. Seqhadex G 50, Sephacel S300 und Bio-
gel P-2 werden häufig als Gelfiltrationsmaterialien für die Reinigung von Nuklein-
säurelösungen verwendet. Die zu reinigende Lösung wird auf die Säule aufgetragen
und anschließend mit Puffer eluiert. Das Eluat wird fraktioniert gesammelt. Häufig
ist das Fließen der Lösung durch die Säule aufgrund der Schwerkraft sehr zeitauf-
wändig. Eine Alternative bieten hier die sog. „Spin Columns“, in denen der Elu-
tionspuffer durch die Säule zentrifugiert wird [4] .

3.2.2.3 Ionenaustauschchromatographie

Das Prinzip der Ionenaustauschchromatographie beruht auf der elektrostatischen
Interaktion zwischen den Zielmolekülen und den funktionellen Gruppen der Säu-
lenmatrix.
Aufgrund ihrer stark negativen Ladung binden DNA-Moleküle reversibel an die
positiv geladene Matrix (Anionenaustauscher). Dabei wird die Salzkonzentration