Extraktion von DNA - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 22

Um die DNA vor einer enzymatischen Degradierung zu schützen, ist eine Inhi-
bierung der Nukleasen (RNasen, DNasen) wichtig. Hierbei spielt die Kühlung der
Proben während der Extraktion eine wichtige Rolle, da die Enzymaktivität durch
niedrige Temperaturen verringert wird. Für die Inhibierung von Nukleasen werden
häufig Chelatbildner, wie z. B. EDTA, eingesetzt, die bivalente Kationen, die als
Kofaktoren der Nukleasen fungieren, binden. Chelatbildner werden häufig schon
dem Homogenisierungspuffer zugegeben [4] .

3.2.2 Entfernung von inhibitorischen Substanzen

und Gewinnung reiner DNA

Nukleinsäurepräparationen können durch Proteine, Nukleasen, Salze, Makromo-
leküle oder andere Nukleinsäuren kontaminiert sein. Wie bereits beschrieben, er-
schweren im Lebensmittel Matrixkomponenten wie Fette, Zucker, Proteine und
sekundäre Inhaltsstoffe die Extraktion. Um am Ende der Isolierung eine reine DNA
zu erhalten, müssen diese entfernt werden.
Für das Entfernen von Kontaminationen und Inhibitoren werden die Eigen-
schaften der DNA wie z. B. Löslichkeit (hydrophil), Ladung und Molekülgröße
ausgenutzt.
Klassisch werden lösliche Proteine durch eine Phenol/Chloroform-Extraktion
entfernt. Dabei macht man sich die Löslichkeit der DNA in Wasser zunutze. Ihre
negative Ladung spielt bei Methoden wie der Ionenaustauschchromatographie eine
Rolle. Bei der Adsorptionschromatographie binden Nukleinsäuren unter hohen
Salzkonzentrationen an Silica, Glas oder Diatomeen. Die Molekülgröße ist bei der
Gelfiltration von Bedeutung. Für die Isolierung großer Mengen an DNA hat sich die
CTAB-Methode als hilfreich erwiesen [4] .
Für eine erfolgreiche Entfernung inhibitorischer Substanzen werden häufig
nach der Lyse Substanzen wie z. B. PVPP, PVP, PEG 400 und Pro-Cipitat zu-
gegeben, die die Inhibitoren binden. Die entstehenden Inhibitorkomplexe können
durch Zentrifugation abgetrennt werden [6] . Erst im Anschluss wird die DNA
aufgereinigt.

3.2.2.1 Phenol/Chloroform-Extraktion

Die klassische Methode lösliche Proteine zu entfernen, stellt das Aufschütteln der
Nukleinsäurepräparation mit gepuffertem Phenol oder Phenol/Chloroform bzw.
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol [25:24:1 (v/v/v)] dar. Phenol denaturiert Pro-
teine, welche dann in der Interphase zwischen wässriger Nukleinsäurelösung und
Phenolphase ausfallen. Durch Zentrifugation wird die Trennung der Phase beschleu-
nigt. Für eine optimale Entfernung der Proteine wird der Phenolschritt wiederholt,
bis keine Interphase mehr zu sehen ist.