Quantitative Analysen - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 260

weichungen (RSD) zu bestimmen. Gemäß diesen Vorschlägen beträgt die RSD bei
der Nachweisgrenze 33 % und bei der Bestimmungsgrenze 25 %.

14.2.2.2 Faktoren, welche die Bestimmungs- und Nachweisgrenze

beeinflussen

Die Bestimmungs- und Nachweisgrenzen von molekularbiologischen Nachweis-
verfahren wie der real-time PCR werden hauptsächlich durch die Anzahl der Ge-
nomkopien in der Reaktion, durch die Präzision der PCR sowie durch die zertifi-
zierte Schwankungsbreite des Referenzmaterials bestimmt.
Die Präzision der Entnahme von kleinen Mengen an Zielmolekülen mittels Pi-
pette kann in Analogie zur Mikrobiologie mithilfe der Poisson-Verteilung berechnet
werden. Dabei ist die Standardabweichung gleich der Quadratwurzel des Mittel-
wertes; d. h. wenn wir im Mittel 100 Zielmoleküle pipettieren, beträgt die Standard-
abweichung 10 und RSD ist 10 %. Bei 25 Zielmolekülen wird bereits eine RSD von
20 % erreicht.
Die Präzision der PCR hängt einerseits von den Schwankungen der Enzymeffi-
zienz und der Stabilität der Taq-DNA-Polymerasenaktivität und andererseits von
der Fluoreszenzdetektion durch die Real-Time-PCR-Geräte ab. Der erste Aspekt
wurde mittels Modelrechnungen [ 4 ] abgeschätzt. Bei einer PCR-Effizienz von
90 %, d. h. 90 % aller Zielsequenzen werden in einem PCR-Zyklus verdoppelt,
variiert die RSD der PCR von 50 % bei einem Zielmolekül über 10 % bei 25 Ziel-
molekülen bis zu 4 % bei 100 Zielmolekülen. Die RSD der Fluoreszenzdetektion
der Real-Time-PCR-Geräte weist große Unterschiede zwischen den verschiedenen
Gerätetypen und -herstellern auf. Die Schwankungsbreite variiert von RSD-Werten
bei 1 bis 10 %.
Schließlich muss berücksichtigt werden, dass das zertifizierte Referenzmaterial,
welches zur Kalibrierung verwendet wird, ebenfalls eine Schwankungsbreite auf-
weist. Dieser Wert wird auf dem Zertifikat ausgewiesen und kann z. B. je nach
GVO-Gehalt und GVO zwischen 25 und 1,1 % variieren.
Gemäß Fehlerfortpflanzungsgesetz nach Gauss wird die Gesamtstreuung aus der
Quadratwurzel der Summe der Quadrate der einzelnen Streuungen berechnet. Bei
Berücksichtigung der drei Faktoren Entnahme von kleinen Mengen an Zielmolekü-
len mittels Pipette, Schwankungen der PCR-Effizienz und Schwankungsbreite des
zertifizierten Referenzmaterials wird ohne Berücksichtigung der Schwankungsbrei-
te der Fluoreszenzdetektion eine Gesamt-RSD von 25 % bei ca. 25 Zielmolekülen
und eine solche von 33 % bei ca. 12 Zielmolekülen erreicht. Damit lässt sich die
Bestimmungsgrenze von Real-Time-PCR-Nachweisverfahren mit 25 bis 50 Ziel-
molekülen, die Nachweisgrenze mit 10 bis 20 Zielmolekülen abschätzen [ 5 ].
Die praktische Bestimmungsgrenze von molekularbiologischen Nachweisver-
fahren hängt wesentlich von der im Verfahren eingesetzten Menge Gesamt-DNA
ab. In den Anfangszeiten der GVO-Analytik wurde, um eine gewisse Normierung
zwischen den verschiedenen Untersuchungslaboratorien anzustreben, im Schweize-
rischen Lebensmittelbuch die Menge der pro PCR einzusetzenden Menge Nuklein-