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aus Wein anhand des
rpoB
-Gens angewendet werden [
23
]. Eine Variante der PCR-
RFLP ist die tRFLP (terminal restriction fragment length polymorphism). Hier wird
einer der PCR-Primer mit z. B. einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Nur das die
Markierung tragende Fragment wird nachgewiesen.
13.3.5.2
Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Hierbei handelt es sich um eine PCR-gestützte Schnellmethode, die eine Unterschei-
dung bis auf Stammebene ermöglicht. Ein zufällig ausgewählter Primer, der gleich-
zeitig als Rückwärts- und Vorwärtsprimer fungiert, bindet an verschiedene Stellen
des Genoms und generiert bei niedriger Annealing-Temperatur (37-42 °C) während
der PCR DNS-Fragmente unterschiedlicher Länge und Intensität. Sequenzinforma-
tionen sind als Grundlage für das Designen der Primer nicht notwendig. Eine gute
und gleichzeitig zuverlässige Auflösung der Isolate kann nur mit einer entsprechend
hohen Anzahl von Wiederholungen unter Einsatz unterschiedlicher Zufallsprimer
erzielt werden. Die Reproduzierbarkeit dieser Methode ist gering, da bestimmte
Einflüsse durch die Qualität der DNS, die Art der Polymerase und Bedingungen der
Amplifikation gegeben sind. Eine laborübergreifende Routineanwendung kommt
daher nicht in Frage. Dennoch gibt es für RAPD eine Vielzahl erfolgreicher An-
wendungsbeispiele, sei es für Hefen in Milchprodukten [
53
,
94
,
124
,
167
], Milch-
säurebakterien in Sauerteig [
32
,
37
,
74
,
178
] oder Gemüse [
119
,
120
] und Staphylo-
kokken in Wurstwaren [
131
,
132
,
137
].
13.3.5.3 AFLP
Bei der AFLP (amplified fragment-length polymorphism) wird DNS mit zwei ver-
schiedenen TypII-Restriktionsenzymen verdaut. Die anschließend an die entstande-
nen Fragmente ligierten 10-15 bp langen Adapter bilden die Basis für deren selekti-
ve Amplifizierung mit markierten Primern. Die Analyse des AFLP-Musters erfolgt
nach gelelektrophoretischer Auftrennung und Detektion der amplifizierten Frag-
mente. Aus Hirseteigen stammende
L. plantarum-
und
Leuconostoc mesenteroides
-
Stämme konnten [
88
], wie
Lactobacillus delbrueckii
subsp.
lactis
in mongolischem
Joghurt mit AFLP identifiziert werden [
10
]. Ebenso wurde AFLP zum Nachweis
von Milchsäurebakterien in Pecorino eingesetzt [
20
].
13.3.5.4
SSCP-Analyse
Bei der SSCP-Analyse (SSCP: single strand conformation polymorphism) wird eine
100-400 bp lange Zielsequenz (z. B. von der 16S-rDNS) amplifiziert und in Einzel-
stränge überführt (entweder mit Exonukleasen oder durch Erhitzen in einer dena-
turierenden Lösung). Die Einzelstränge bilden nach (erneuter) Denaturierung und
schnellem Abkühlen in Eiswasser sequenzspezifische Sekundärstrukturen aus, die
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