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stehenden DNS-Fragmente werden anschließend mittels Agarosegelelektrophorese
aufgetrennt. Aufgrund der hohen Anzahl an Banden ist eine Auswertung der Muster
oft schwierig. REA wurde zum Beispiel zur Differenzierung von
Lactobacillus ca-
sei, Lactobacillus rhamnosus
und
Lactobacillus reuteri
angewandt [
2
,
149
]. Eine
Hybridisierung mit entsprechenden Gensonden reduziert die Komplexität der Mus-
ter (s. 13.3.4.4).
13.3.4.4
RFLP/Ribotyping
Die Differenzierung mittels Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)
basiert auf unterschiedlichen Restriktionsfragmentmustern aufgrund unterschied-
licher DNS-Sequenzen. Dafür wird chromosomale DNS mit Restriktionsendonu-
kleasen in Fragmente unterschiedlicher Längen verdaut. Diese werden elektro-
phoretisch aufgetrennt (s. 13.3.4.3) und auf Nylon oder Nitrocellulosemembranen
geblottet. Markierte Sonden werden anschließend mit den immobilisierten Frag-
menten hybridisiert. Aus dem Hybridisierungsmuster kann auf die Zugehörigkeit zu
einer bestimmten Spezies geschlossen werden. Verbreitetste Variante der RFLP ist
das Ribotyping, bei dem für 23S-, 16S- und 5S-rRNS spezifische Sonden eingesetzt
werden. Verschiedene
Lactobacillus sanfranciscensis-
Stämme konnten sowohl mit
Ribotyping [
82
] als auch mit auf der Insertionssequenz IS153 basierender RFLP.
erfolgreich differenziert werden. Ebenfalls mit einer für ein Insertionselement
spezifischen Sonde (IS1201) konnte RFLP zur Identifizierung von
Lactobacillus
helveticus
eingesetzt werden [
67
], während de Carvalho et al. Propionibacterium-
Spezies mittels Ribotyping differenzieren konnten [
35
]. Zur weiten Verbreitung des
Ribotypings hat die Entwicklung des automatisierten RiboPrinter
®
-Systems (Du-
Pont Qualicon) beigetragen. Eine Differenzierung ist je nach verwendetem Zielgen
bis auf Stammebene möglich.
13.3.5
PCR-gestützte Verfahren zur Genotypisierung
13.3.5.1
PCR-RFLP
Amplifizierte DNS-Bereiche, die im Vergleich verschiedener Stämme einer Bakte-
rienspezies einen variablen Aufbau zeigen, können mit Restriktionsenzymen verdaut
und die erzeugten Fragmente mit der Gelelektrophorese separiert werden. Unter-
schiede im Restriktionsmuster gehen einher mit Sequenzvariationen im Bereich der
amplifizierten DNS und erlauben somit eine Differenzierung von Mikroorganis-
men. Roy et al. [
141
] nutzten PCR-RFLP zum spezies- und gruppenspezifischen
Nachweis verschiedener für die Fermentation von Milchprodukten relevanten
Lac-
tobacillus
-Arten. Ruiz et al. [
142
] konnten Essigsäurebakterien mittels PCR-RFLP
bestimmten Gattungen und in Einzelfällen auch der jeweiligen Art zuordnen. PCR-
RFLP konnte ebenfalls erfolgreich zur Differenzierung von Milchsäurebakterien
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