Einsatz molekularer Methoden für Starterkulturen - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 229

in Wurstwaren, das später auch von Nissen und Dainty [ 113 ] erfolgreich eingesetzt
werden konnte, während Langa et al. [ 90 ] Dot-blot-Hybridisierungen zur Differen-
zierung probiotischer Enterococcus faecium -Stämme, von Lactobacillus delbrue-
ckii subsp. bulgaricus und Streptococcus thermophilus in Milchprodukten anhand
der 16S/23S-Spacer-Region nutzten. Mit ähnlicher Methodik gelang es Ampe et al.,
die Zusammensetzung der Flora einer Fermentation von Pozol, einem mexikani-
schen Maisbrei, in ihrer zeitlichen Entwicklung darzustellen [ 4 ]. Sie zeigten, dass
hier zunächst Leuconostoc- und Lactococcus- Spezies vorherrschen, in späteren
Fermentationsstadien jedoch Lactobacillus -Spezies.
Zur Koloniehybridisierung werden Zellen direkt auf der Membran kultiviert bzw.
Zellmaterial aufgebracht (Abklatschverfahren), bevor die DNS der Einzelkolonien
durch Lyse freigesetzt und so an die Membran gebunden wird. Beide Hybridisie-
rungsvarianten setzen die Kultivierung der zu identifizierenden Isolate voraus. Es
wird pro Membran nur mit einer Gensonde gleichzeitig hybridisiert und damit nur
Isolate einer einzelnen Spezies pro Hybridisierung identifiziert. Koloniehybridisie-
rungen haben gegenüber Dot-blot-Verfahren den Vorteil, dass eine Spezies auch
semiquantitativ detektiert werden kann. Zudem können Koloniehybridisierungen
auch zur Detektion von in geringen Mengen vorkommenden Organismen in Le-
bensmitteln eingesetzt werden, wie beispielsweise Bhunia und Johnson anhand
von Pediococcus acidilactici aus fermentierten und nichtfermetierten Wurstwaren
zeigten [ 13 ].
Werden nicht die isolierten Nukleinsäuren selbst, sondern die Gensonden auf
der Membran fixiert und markierte Nukleinsäuren aus Rein- oder Mischkulturen
mit den Gensonden hybridisiert, spricht man von reversem Dot-blot-Verfahren. Die
Vorteile des reversen dot-blots liegen darin, dass keine Kultivierung der Isolate not-
wendig ist und dank der Immobilisierung der Gensonden beliebig viele Spezies
gleichzeitig nachgewiesen werden können [ 43 ].
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
Die Fluoreszenz- in-situ -Hybridisierung (FISH) kann Starterkulturen direkt in ihrem
Habitat ohne kulturabhängige Zellisolierung identifizieren [ 17 ]. Dafür werden die
Zellen auf Objektträger fixiert und die Zellwände für die mit Fluoreszenzfarbstoffen
markierten 15-30 bp langen Gensonden permeabilisiert. Die Gensonden werden
mit hoher Stringenz hybridisiert und die markierten Zellen mit Fluoreszenzmikro-
skopen bzw. Durchflusscytometern detektiert.
Da dem FISH-Verfahren keine Voranreicherung oder Amplifizierung per PCR
vorgeschaltet ist, muss die Ziel-DNS bereits in hoher Kopienzahl in der Zelle vor-
liegen. Zur Identifizierung von Starterkulturen werden daher v. a. Oligonukleotid-
sonden, die auf rRNS-bzw. rDNS-Sequenzen abzielen, verwendet. Die Identifizie-
rung kann bis zur Subspeziesebene möglich sein [ 17 ].
Die hohe Sensitivität (der Nachweis einzelner Zellen ist möglich) und die Schnel-
ligkeit (keine Kultivierung, DNS-Isolierung notwendig) lassen FISH als ideales
Identifizierungssystem erscheinen.