Einsatz molekularer Methoden für Starterkulturen - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 228

13.3.2 Anwendung von Gensonden

Als Gensonde bezeichnet man ein einzelsträngiges DNS-Molekül, das gensequenz-
spezifisch bzw. organismenspezifisch an einen zweiten Einzelstrang binden kann.
Hierbei entsteht ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül (Hybrid). Der Vorgang
wird als Hybridisierung bezeichnet. Der wesentliche Nachteil der Gensondeniden-
tifizierungsverfahren liegt darin, dass im Gegensatz zur vergleichenden Sequenz-
analyse von Markergenen die richtige Wahl der Gensonde ein bestimmtes Maß an
Vorwissen über die zu erwartenden Identitäten des nachzuweisenden Mikroorganis-
mus verlangt.

13.3.2.1 Prinzip der Hybridisierung und Hybridisierungstechniken

Der Begriff Hybridisierung bezeichnet den Vorgang der Bindung zweier einzel-
strängiger Nukleinsäuren zu einem Doppelstrang. Geschwindigkeit und Spezifität
der Hybridisierung werden im Wesentlichen von der Hybridisierungstemperatur,
der Ionenstärke, von den die Schmelztemperatur beeinflussenden Zusätzen der Hy-
bridisierungslösung, der Sondenlänge sowie der Sondensequenz bestimmt.
Der Nachweis einer erfolgten Hybridisierung geschieht durch eine Markierung
der Gensonde, die radioaktiv bzw. durch Kopplung von Fluoreszenzfarbstoffen
oder Enzymen erreicht wird.

13.3.2.2 Geeignete Zielsequenzen (Gene)

Die Länge einer Gensonde kann zwischen wenigen Nukleotiden (Oligonukleotid)
und mehreren Tausend Nukleotiden (Polynukleotid) variieren. Die Spezifität der
Sonde wird durch ihre Länge und die Reihenfolge der Nukleotide bestimmt. Als
Zielsequenz ist, wie schon bei der vergleichenden Sequenzierung von Markergenen
(vgl. Abschn. 13.3.1), die Nutzung ribosomaler RNS-Gene am weitesten verbreitet.
Es können aber auch konservierte Gene zentraler Stoffwechselwege [ 160 ] und/oder
speziesspezifische Gene verwendet werden.

Festphasenhybridisierungen

Bei Festphasenhybridisierungsverfahren ist einer der beiden Bindungspartner (Son-
de oder Ziel-DNS) an einer festen Phase (Membran, magnetische Partikel, Mikro-
titerplatte oder Glas) fixiert. Es wird zwischen Dot-blot-Hybridisierung, reverser
Dot-blot-Hybridisierung und Koloniehybridisierung unterschieden.
Bei Dot-blot-Hybridisierungen werden aus Reinkulturen isolierte Nukleinsäuren
der zu identifizierenden Starterkulturen auf Membranen fixiert.
Hertel et al. [ 76 ] entwickelten ein auf der 23S-rRNS basierendes speziesspezifi-
sches System zum Nachweis von L. sakei, L. curvatus, L. pentosus , und L. plantarum