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ITS-Regionen, sodass die Entwicklung an diagnostischen PCR-Methoden über die-
sen Ansatz nur schwer möglich ist. Trotz dieser Probleme ist es Pedersen et al. (
1997
)
gelungen, ein PCR-System zum generellen Nachweis von Penicillien und zum spe-
ziellen Nachweis von
P. roqueforti
und
P. carneum
zu entwickeln. Fusarien besitzen
eine höhere Variabilität in den ITS-Regionen (O'Donnel,
1992
). Dementsprechend
sind mehrere PCR-Nachweissysteme anhand dieser Bereiche beschrieben worden
(Schilling et al.,
1996
; Bluhm et al.,
2002
; Kulik et al.,
2004
) obwohl auch hier bei
der Differenzierung bestimmter Spezies Schwierigkeiten auftreten (Schilling et al.,
1996
). Basierend auf Unterschieden in den ITS-Regionen konnten Gil-Serna et al.
(
2009
) eine Real-Time-PCR-Methode zur Unterscheidung und Quantifizierung der
sehr nahe verwandten Arten
A. oryzae
und
A. westerdijkiae
beschreiben. Beide Spe-
zies sind potenzielle Ochratoxin-A-Bildner. Eine weitere Möglichkeit der Entwick-
lung spezifischer Primer bilden die sogenannten IGS-Regionen oder „Intergenic
Spacer Regions“. Pilze besitzen in der Regel mehrere (50-100) ribosomale Gene,
die meist an einem bestimmten Ort im Genom geclustert vorliegen. Die einzelnen
ribosomalen Geneinheiten sind dabei um einen gewissen Sequenzbereich vonein-
ander getrennt, der IGS-Region. Diese IGS-Region kann wiederum variabel sein
und zur Entwicklung von spezifischen Primer-Paaren verwendet werden. Llorens
et al. (
2006
) konnten die IGS-Region benutzen, um mykotoxinproduzierende
Fu-
sarium-
Spezies zu charakterisieren. Patino et al. (
2006
) setzten die Variabilität in
den IGS-Regionen ein, um zwischen
F. verticillioides-
Stämmen, die von Bananen
isoliert wurden und kein Fumonisin produzierten, und Stämmen von Cerealien, die
starke Fumonisinbildner waren, zu unterscheiden. González-Salgado et al. (
2005
)
beschrieben eine PCR-Methode, um
Aspergillus-
Spezies der Sektion
Nigri
anhand
der Unterschiede der IGS-Regionen zu differenzieren. Zur Sektion
Nigri
gehören
u. a. Ochratoxin-A-produzierende Spezies, wie
A. carbonarius
oder
A. niger
. Beide
Spezies sind morphologisch nur schwer zu unterscheiden, was insgesamt für die
innerhalb dieser Gruppe vorkommenden Aspergillen gilt.
Eine weitere Möglichkeit, spezifische Zielsequenzen für mykotoxinbildende
Gene zu erhalten, ist die Entwicklung sogenannter SCAR-Primer (SCAR = Sequen-
ce Characterized Arbitrary Regions). Diese Methode der Primer-Entwicklung eig-
net sich auch für Spezies, von denen keine Informationen über Genom- oder DNA-
Sequenzen vorliegen. Für die Entwicklung von SCAR-Primern wird zunächst eine
RAPD- oder AFLP-Typisierung verschiedener Stämme der interessierenden myko-
toxinbildenden Spezies und auch verschiedener relevanter Pilzspezies, die im glei-
chen Lebensmittelhabitat vorkommen, durchgeführt. Die erhaltenen RAPD- oder
AFLP-Fragmentmuster werden miteinander verglichen. In der Regel unterscheiden
sich die Muster. Im günstigsten Fall kann bei dieser Typisierung eine Bande ge-
funden werden, die ausschließlich in den mykotoxinbildenden Spezies vorkommt.
Bei diesem PCR-Produkt (dessen genetische Information nicht bekannt ist) handelt
es sich dann um einen sogenannten „anonymen Marker“ für die Mykotoxinbildung.
Diese Bande wird anschließend aus dem Gel ausgeschnitten und das PCR-Produkt
wird sequenziert. Anhand der erhaltenen Sequenz können dann Primer entwickelt
werden, die durch eine Reihe von PCR-Reaktionen auf ihre Spezifität getestet wer-
den. Mithilfe dieses Ansatzes wurden viele spezifische Primer für mykotoxinbilden-
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