Molekulare Methoden zum Nachweis, zur Quantifizierung und zum Monitoring der Mykotoxinbildung lebensmittelrelevanter Pilze - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 198

de Pilze entwickelt. Möller et al. ( 1999 ) benutzten diesen Ansatz, um spezifische
PCR-Systeme für die beiden fumonisinbildenden Fusarien-Spezies F. verticillioides
und F. subglutinans zu entwickeln. Sie konnten diese beiden Spezies in infiziertem
Mais mittels der PCR-Methode nachweisen. Parry und Nicholson ( 1996 ) entwi-
ckelten ebenfalls ein PCR-System zum Nachweis von F. poae in Weizen mittels der
SCAR-Technik. Mithilfe dieses PCR-Systems konnte F. poae in Weizenproben mit
einer Sensitivität nachgewiesen werden, die mit konventionellen Methoden nicht
möglich war. Die am stärksten kontaminierte Probe ergab mit diesem PCR-System
das stärkste Signal, sodass gewisse Rückschlüsse auf die Kontaminationshöhe ge-
zogen werden konnten. Auch für Ochratoxin-A-bildende Aspergillen wurde dieses
Verfahren angewandt. Fungaro et al. ( 2004 ) wiesen A. carbonarius in Kaffee mit
einer PCR-Reaktion nach, deren Primer durch die SCAR-Technik entwickelt wur-
den. Ein ähnliches System, allerdings für A. ochraceus , ebenfalls ein Ochratoxin-A-
bildender Aspergillus , wurde von Schmidt et al. ( 2003 ) beschrieben.
Diese Beispiele zeigen, dass es mit diesem Ansatz möglich ist, im Prinzip für
jede Spezies ein spezifisches PCR-System zu entwickeln, auch wenn keine Se-
quenzinformation vorhanden ist.
Es besteht weiterhin die Möglichkeit, Gene, deren Präsenz oder deren variab-
le Sequenzen an die Mykotoxinbildung gekoppelt sind, als Zielsequenzen zu ver-
wenden. So benutzten Niessen und Vogel ( 1997 ) das nur in F. graminearum vor-
kommende Galaktoseoxidasegen (gaoA), um diese trichothecenbildende Spezies
nachzuweisen. Perrone et al. ( 2004 ) entwickelten spezifische Primer anhand von
variablen Sequenzen im Calmodulingen. Sie waren damit in der Lage, Ochratoxin-
A-bildende A. carbonarius -Stämme von nicht-Ochratoxin-A-bildenden A. japoni-
cus -Stämmen zu unterscheiden. Beide Spezies gehören zu den „Black Aspergilli“
und sind morphologisch nicht zu unterscheiden.
Die eleganteste Möglichkeit der Primer-Entwicklung erfolgt natürlich über die Se-
quenz der biosynthetischen Gene der Mykotoxine selbst. Voraussetzung ist die Ver-
fügbarkeit der mykotoxinbiosynthetischen Gene. In den vergangenen Jahren wurden
viele molekulare Grundlagen, besonders für die lebensmittelrelevanten Mykotoxi-
ne, erarbeitet. So wurde der gesamte Gencluster der Aflatoxinbildung von Yu et al.
( 2004 ) beschrieben. Zusätzlich ist das Genom von A. flavus , einem wichtigen aflato-
xinbildenden Pilz nahezu vollständig sequenziert (www.aspergillusflavus.org). Ähn-
liches gilt für den Trichothecenbildner F. graminearum (Brown et al., 2003 ), für den
ebenfalls die Genomsequenzen vorliegen (http://mips.gsf.de/genre/proj/fusarium/;
http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/fusarium_graminearum/Home.html)
sowie für die wichtigste fumonisinbildende Spezies F. verticilliodes (Proctor et al.,
2003 ),Genomsequenz:http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/fusarium_group/
MultiHome.html).
Auch einige der ochratoxinbiosynthetischen Gene sind in den letzten Jahren be-
schrieben worden (O'Callaghan et al., 2003 ; Karolewiez u. Geisen, 2005 ; Geisen
et al., 2006 ), sowie Schlüsselenzyme der Patulinbiosynthese (Beck et al., 1990 ;
Dombrink-Kurtzmann, 2006 ). Damit besteht die Möglichkeit, PCR-Systeme an-
hand der biosynthetischen Gene für aflatoxin-, trichothecen-, fumonisin-, ochra-
toxin- und patulinbildende Pilze zu entwickeln. In der Tat sind viele diagnostische