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12.3
Zielsequenzen
Das Prinzip einer diagnostischen PCR zum Nachweis eines mykotoxinbildenden
Pilzes ist der indirekte Nachweis eines spezifischen PCR-Produktes, das nur in
dem jeweiligen Mykotoxinbildner vorkommt. Die Herausforderung bei der Ent-
wicklung spezifischer PCR-Reaktionen für mykotoxinbildende Pilze ist daher die
Identifizierung von Sequenzen, die spezifisch nur in dem nachzuweisenden Pilz
vorkommen. Zur Identifizierung spezifischer Sequenzen sind verschiedene Ansätze
angewandt worden. Die naheliegendste Möglichkeit, spezifische DNA-Bereiche als
Zielsequenzen für eine PCR zu finden, ist der Einsatz von Bereichen mykotoxinbio-
synthetischer Gene. Inzwischen sind die Gencluster der biosynthetischen Gene der
meisten lebensmittelrelevanten Mykotoxine bekannt. So sind die Biosynthesegene
für die Aflatoxinbildung durch
A. flavus
oder
A. parasiticus
(Yu et al.,
2004
), die
Trichothecenbildung durch
F. sporotrichioides
oder
F. graminearum
(Brown et al.,
2001
), die Fumonisinbildung durch
Gibberella moniliformis
(Proctor et al.,
2003
),
die Ochratoxinbildung durch
Penicillium
(Geisen et al.,
2006
) oder
Aspergillus och-
raceus
(O´Callaghan et al.,
2003
) oder Gene, die mit der Patulinbiosynthese korre-
liert sind (Wang et al., 1991), bekannt. Eine Vielzahl an verschiedenen spezifischen
PCR-Systemen, die auf biosynthetischen Genen als Template beruhen, sind daher
beschrieben worden.
Vor der praktischen Überprüfung der Spezifität der Primer durch PCR-Reaktio-
nen mit einer Vielzahl an verschiedenen produktrelevanten Pilzen sollte eine Über-
prüfung mittels BLAST gegenüber der in einer Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/) gesammelten Sequenzen erfolgen. Diese Analyse ermöglicht schon eine erste
Vorauswahl.
Für mykotoxinogene Pilze, von denen die Genomsequenz bzw. die Sequenz des
mykotoxinbiosynthetischen Clusters noch nicht bekannt sind, können andere Ansät-
ze angewandt werden, um spezifische Primer zu entwickeln. Diese Ansätze wurden
naturgemäß in der Prä-Genom-Ära angewandt. Viele spezifische PCR-Systeme be-
ruhen auf Unterschieden in den ITS-Regionen der ribosomalen Gene (Abb.
12.1
).
Sowohl die ITS-Regionen als auch die IGS-Regionen können Variabilitäten auf-
weisen, die zur Entwicklung von spezifischen Primern ausgenutzt werden können
(O'Donnell,
1992
). In der Literatur findet man viele Beispiele, bei denen Unter-
schiede in den ITS-Regionen ausgenutzt wurden, um spezifische diagnostische
PCR-Systeme für mykotoxinbildende Pilze zu entwickeln. Die Anwendung dieses
Ansatzes hängt allerdings stark von der Variabilität der ITS-Regionen innerhalb
einer Spezies ab. Besonders die Penicillien besitzen eine geringe Variabilität in den
IGS
ITS I
ITS II
IGS
ITS I
ITS II
IGS
small
rDNA
5.8 S
rDNA
large
rDNA
small
rDNA
5.8 S
rDNA
large
rDNA
ITS PCR
IGS PCR
ITS PCR
Abb. 12.1
Schematische Darstellung des Aufbaus der ribosomalen Gene von Pilzen
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