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Aufgrund der Möglichkeiten, die die molekularen Methoden zur Bestimmung
des mykotoxikologischen Status eines Lebensmittels bieten, können sie als proaktiv
eingestuft werden und sind im Rahmen eines HACCP-Konzeptes besser geeignet,
Hinweise zur Vermeidung der Mykotoxinbildung zu liefern, als die postaktiven
analytischen Methoden.
12.2
Grundlagen der molekularen Methoden
Die übliche molekulare Methode zum Nachweis mykotoxinbildender Schimmelpil-
ze ist die konventionelle PCR. Das Prinzip dieser Methode beruht darauf, dass ein
spezifisches DNA-Fragment, das nur in dem nachzuweisenden, mykotoxinbilden-
den Pilz vorkommt, mittels PCR amplifiziert wird und z. B. durch Elektrophorese
nachgewiesen wird. Es handelt sich also um ein indirektes Verfahren zum Nachweis
des Pilzes. Vorteil der Methode ist ihre Geschwindigkeit und ihre Spezifität. Wenn
das Primer-Paar sorgfältig ausgewählt wurde, erscheint nur bei dem entsprechenden
Pilz ein positives Signal. Allerdings ist mit der konventionellen PCR nur eine Ja/
Nein-Antwort möglich. Es können z. B. keine Aussagen über den Grad der Infektion
gemacht werden. Für viele mykotoxinbildende Spezies sind daher inzwischen Real-
Time-PCR-Systeme entwickelt worden, die eine Quantifizierung der Schimmelpilze
erlauben (Andersen et al.,
2006
; Haugland et al.,
2004
; Schnerr et al.,
2001
; Mayer
et al.,
2003a
; Morello et al.,
2007
; Selma et al.,
2009
). Dabei spielt auch bei die-
ser Methode die Problematik der Quantifizierung von Schimmelpilzen eine Rolle.
Schimmelpilze bilden Sporen und Mycelfragmente. Daher ist eine eindeutige und
absolute Quantifizierung, wie sie für Bakterien möglich ist, hier nicht durchführbar.
In der Regel wird aber trotz dieser Problematik eine gute Korrelation zwischen der
Keimzahl (Plattenverfahren) und den Real-Time-PCR-Werten erhalten. Die Real-
Time-PCR-Werte sind allerdings meist um einen Faktor von 100 bis 1000 höher als
die entsprechenden Keimzahlwerte (Mayer et al.,
2003b
). Dies hat mehrere Gründe.
Bei der Keimzahlbestimmung mittels Plattenverfahren werden hauptsächlich die
freigesetzten Sporen bestimmt. Mycelfragmente spielen nur eine untergeordnete
Rolle, da Mycelfragmente, auch wenn sie aus vielen Zellen bestehen, nur eine Kolo-
nie ergeben. Die Sporen der lebensmittelrelevanten Pilze sind meistens uninucleat.
Wenn die Target-Sequenz nur einmal im Genom vorkommt, sollte die mittels real-
time PCR ermittelte Genomkopienzahl in etwa mit der cfu-Zahl („colony forming
units“) übereinstimmen. Dies ist bei den uninucleaten Sporen der Fall. Die filamen-
tösen Hyphen sind dagegen in der Regel multinucleat und können mehrere bis viele
Kerne enthalten. Es gibt Hinweise, dass bis zu 1000 Kerne in der Zelle vorkommen
(Maheshwari,
2005
). Wenn die DNA-Isolierungsmethode effektiv ist und die DNA
vollständig isoliert wird, trägt jeder Kern einer Zelle zur Kopienzahl bei und erhöht
sie entsprechend, während eine Zelle den cfu-Wert nur um eins erhöht.
Werden diese Tatsachen in Betracht gezogen, eignet sich die real-time PCR sehr
gut, um eine Aussage über die Biomasse eines Pilzes in einer Probe zu machen.
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