Chemistry Reference
In-Depth Information
Institute of Reference Materials and Measurement der EU-Kommission verfügbar
[
36
].
Validierungsstudien und Anforderungen
Real-Time-PCR-Verfahren zur Quantifizierung von GVP sind bereits in erheblicher
Anzahl validiert worden. Eventspezifische Verfahren für zuzulassende GVP wer-
den im Rahmen des ENGL validiert [
35
], daneben sind im Ringversuch validierte
konstruktspezifische in der Norm EN ISO 21570 [
24
] beschrieben. Die Validierung
von Real-Time-PCR-Verfahren zur Quantifizierung erfolgt möglichst anhand zerti-
fizierter Referenzmaterialien sowie von Probenmaterialien mit definierten GVP-
Anteilen.
Ansätze zur laborinternen Validierung wurden beschrieben [
37
]. Für eventspe-
zifische Verfahren, welche die Antragsteller im Rahmen von Zulassungsverfahren
vorlegen müssen, hat das ENGL Annahmekriterien für Validierungsdaten definiert
[
38
] (s. Tab.
10.1
).
Anhand von DNA-Verdünnungsreihen, welche auf verschiedenen Konzent-
rationsniveaus in Replika untersucht werden, können der Arbeitsbereich und die
Regressionsdaten (und damit auch die PCR-Effizienz) der beiden für die relative
Quantifizierung benötigten Real-Time-PCR-Systeme berechnet werden. Die hier-
bei erhaltenen Präzisionsdaten können auch für die Ermittlung der Sensitivität
Tab. 10.1
ENGL-Annahmekriterien [
37
] für Validierungsdaten eventspezifischer Methoden;
Daten aus Inhousevalidierungen bzw. aus Ringversuchen (sofern explizit in Tabelle erwähnt)
Spezifität
Testen mit:
• Transgenen Events (insbesondere eng verwandte)
• Nicht transgenem Material (selbe Spezies bei eventspezifischer
PCR)
Arbeitsbereich
(inhouse-
und Ringversuch)
1/10 bis 5 faches der Zielkonzentration (=häufig 500 Kopien; d. h.
50 bis 2500 Kopien)
Richtigkeit
(Inhouse- und
Ringversuch)
max. ± 25 % des Referenzwertes (über den gesamten
Arbeitsbereich)
Steigung/PCR-Effizienz
−3,1 ≥ Steigung Kalibrierreihe ≥ −3,6 (Effizienz ca. 90-110 %)
R
2
(Bestimmtheitsmaß der
Regression)
>0,98
Wiederholungsstandardab-
weichung
RSD
r
< ± 25 % über den gesamten Arbeitsbereich (mindestens 15
Replika)
Reproduzierbarkeitsstan-
dardabweichung
RSD
R
(Ringversuch)
< ± 35 % über den gesamten Arbeitsbereich
< ± 50 % bei Anteilen gentechnischer Veränderungen unter 0,2 %
Bestimmungsgrenze
Kriterium: RSD
r
< ± 25 %: <1/10 der Zielkonzentration z. B. < 50
Kopien
Nachweisgrenze
Kriterium: 95 % positive; ≤5 % falsch-positive: <1/20 der Ziel-
konzentration, z. B. <25 Kopien (Anm: Kriterium EN 24276
[
8
] für quantitative Verfahren [Ringversuche]: RSD
R
≤ 33 %)
Robustheit
Inter-Assay-Abweichung < ±30 %
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