Molekularbiologische Speziesdifferenzierung - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 138

Mit diesem Verfahren kann nach entsprechender Validierung unter Verwendung
von Gemischen (1 %, 5 %, 10 % und 50 %) der prozentuale Anteil aller relevanten
Tierarten ermittelt werden. Bei Validierungsuntersuchungen ist der Fett- und Binde-
gewebsgehalt der Gewebearten bei Herstellung der Vergleichsproben zu beachten,
das Material ist so auszuwählen, dass es den tatsächlichen Gegebenheiten sowie den
gesetzlichen Anforderungen entspricht.
Die quantitative Tierartbestimmung weist Limitierungen auf. Es bestehen Unter-
schiede in der Zelldichte bzw. in der Zahl der Zellkerne pro Masseeinheit. Die
ermittelten Zahlen sind der Ausdruck des Verhältnisses der DNA und damit der
Zellkerndichte in den verwendeten Geweben. Von diesen Zahlen kann nur mittel-
bar auf den Muskelfleischanteil der eingesetzten Arten geschlossen werden, da der
Anteil der Zellkerne und damit der DNA-Gehalt der Gewebe unterschiedlich ist.
Dies muss bei der Interpretation von komplex zusammengesetzten Erzeugnissen
in Betracht gezogen werden. Ist die Rezeptur bekannt, wie es bei der quantitativen
Angabe der Zutaten oft der Fall ist, oder folgt die Rezeptur des Erzeugnisses vor-
geschriebenen Werten, kann unter Berücksichtigung des DNA-Gehaltes der ein-
gesetzten Gewebe der Anteil der Spezies bestimmt werden. Der DNA-Gehalt von
Muskulatur und Bindegewebe von Rind und Schwein beträgt gemäß Trübner [ 33 ]
nach der standardmäßig angewandten CTAB-Extraktion 200 µg/ml, jener von Fett-
gewebe beträgt beim Schwein 90 µg/ml und beim Rind 35 µg/ml und ist damit er-
heblich geringer. Erheblich höher ist der DNA-Gehalt der Organe Milz, Leber und
Niere mit 700-1500 µg/ml [ 33 ]. Die Relationen des DNA-Gehaltes sind somit zwi-
schen verschiedenen Geweben der Arten Rind und Schwein ähnlich. Unter Berück-
sichtigung des durch Rechtsnormen definierten maximalen Anteils von Fett- und
Bindegewebe von Fleisch verschiedener Tierarten kann ausgehend vom Verhältnis
der DNA auf das Verhältnis des eingesetzten Muskelfleisches geschlossen werden.
Quantitative Bestimmung von Pflanzenarten
Fälschungsschutz wird bei dem Nachweis von Weichweizen in Produkten, die aus-
schließlich aus Hartweizen hergestellt werden, erforderlich [ 2 , 32 ]. Die Methoden
basieren analog zur quantitativen Tierartbestimmung auf der quantitativen real-time
PCR. Mit einem Primer-Sondensystem, bindend im Lipid-Transfer-Protein-Gen
wird Weizen-DNA ( Triticum aestivum - Weichweizen und Triticum durum - Hart-
weizen) gleichermaßen amplifiziert. Ein zweites System ist spezifisch für Triticum
aesivum , es amplifiziert einen Teil aus dem Puroindolin-Gen. Dieses Gen fehlt in
Hartweizen. Zur Quantifizierung werden Standards aus Hartweizen mit Anteilen
von 1 %, 3 %, 5 % und 10 % hergestellt. Anhand dieser Standards kann der An-
teil an Weichweizen in Erzeugnissen aus Hartweizen bestimmt werden. Primer und
Sonden sind in Tab. 9.1 aufgeführt.
Die quantitative Bestimmung erfolgt als relative Quantifizierung. Ein definier-
tes Gemisch aus 95 % Hartweizen und 5 % Weichweizen (jeweils Massenantei-
le) dient als Standardreihe. Den Verdünnungsstufen der Standards werden relative
Kopienzahlen zugeordnet. Den höheren Konzentrationen werden davon ausgehend