Molekularbiologische Speziesdifferenzierung - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 137

Da viele Verarbeitungsschritte von Lebensmitteln die DNA fragmentieren, ist
dieses System nur für wenig verarbeitete Matrizes geeignet. Als Amplifikations-
kontrolle bei der Anwendung kurzer Fragmente, wie sie in der real-time PCR mit
TaqMan-Sonden nahezu ausschließlich verwendet werden [ 17 ], hat Zeltner [ 35 ] das
TR-System von Allmann et al. [ 3 ] mit einer pflanzenspezifischen Sonde versehen.
Dieses Primer-Sondensystem wird als Amplifikationskontrolle der real-time PCR
zum Nachweis der Zöliakie-auslösenden Pflanzenarten Weizen, Roggen, Dinkel,
Kamut, Gerste und Hafer angewandt. Ein System dient zum Nachweis von Weizen
und Roggen sowie der verwandten Arten Dinkel und Kamut bei einer Nachweis-
grenze von 5 mg Weizen pro Kilogramm Erzeugnis, je ein weiteres Primer-Sonden-
system für Gerste und für Hafer weist eine Nachweisgrenze von 10 mg/kg auf.

9.2.3.3 Quantitative Speziesanalyse

Quantitative Tierartbestimmung

Für die quantitative Tierartbestimmung hat sich die real-time PCR durchgesetzt [ 12 ,
19 , 20 ]. Voraussetzung dafür ist die Homogenisierung einer ausreichend großen
Probenmenge, vollständige Lysis des Probenmaterials und eine effiziente DNA-Ex-
traktion.
Die quantitative Tierartbestimmung erfolgt als relative Quantifizierung. Durch
real-time PCR werden dabei die relative Kopienzahl einer Art durch ein spezifisches
Primer-Sondensystem bestimmt. In einer zweiten, parallel ablaufenden Reaktion
wird die Kopienzahl der taxonomischen Gruppe bestimmt, zu der die relevanten
Arten gehören; es sind Systeme zum Nachweis von Säugetier-DNA oder zum ge-
meinsamen Nachweis von Säugetier- und Geflügel-DNA verfügbar [ 19 , 20 ].
Das universelle Primer-System im Myostatin-Gen amplifiziert den gleichen
Genabschnitt aller Säugetiere und Nutzgeflügelarten, dadurch wird der gesamte An-
teil von aus Nutztieren stammender DNA bestimmt. In weiteren Reaktionen wird
die DNA der zu quantifizierenden Spezies ermittelt.
In beiden Reaktionen kann die DNA der zu quantifizierenden Tierart als Stan-
dardreihe in absteigender Verdünnungsreihe, z. B. jeweils 1:5, 1:25, 1:125, 1:625,
1:3125 und 1:15.625 verwendet werden. Da beide Gene im gleichen Verhältnis
vorliegen, wird jeder der Stufen die gleiche relative Kopienzahl zugeordnet, dies
sind bei genannter Reihe entsprechend 31.250, 6250, 1250, 250, 50 und 10 Kopien.
Wichtig ist, dass weder in der Standardreihe noch in der Proben-DNA Inhibitionen
auftreten. Dies wird überprüft, indem die DNA in zwei Verdünnungsstufen einge-
setzt wird, die Differenz der C t -Werte zwischen den Stufen muss der theoretischen
Differenz entsprechen. Bei einer Vierfachverdünnung beträgt die Differenz der
C t -Werte 2, bei der genannten Standardreihe mit Fünffachverdünnung etwa 2,24.
Aus den C t -Werten der Proben-DNA in beiden Systemen wird bei Gültigkeit der
Voraussetzungen die relative Kopienzahl der Nutztier-DNA und der bovinen DNA
berechnet, davon ausgehend wird der Anteil boviner DNA bestimmt.