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Abb. 9.4
Spezifische PCR für Rind (
a
) und die resultierenden Restriktionsfragmente (
b
) mit den
Enzymen
Alu
I (
links
) und
Hae
III (
rechts
) zur Bestätigung. Probe 2 enthält Rind. MM - Reagen-
zienkontrolle, LP - Extraktionsnegativkontrolle, PK Rind 1 % - Positivkontrolle, bestehend aus
1 % Rindfleisch und 99 % Schweinefleisch (jeweils Gewichtsanteile), PK Schaf - mitgeführte
Spezifitätskontrolle Schaf, die in dieser Reaktion negativ sein sollte
Zur Analyse stehen wiederum RFLP und DNA-Sequenzierung zur Verfügung.
Als Enzyme für den RFLP werden
Hae
III,
Taq
1,
Sau
3A und
Nla
III angewandt.
In der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren werden die Restriktions-
fragmente von marktrelevanten Arten aufgelistet [
5
]. Nach dem in der amtlichen
Sammlung festgelegten Verfahren werden die Restriktionsfragmente auf einem
hochauflösenden 2,5 %igen Agarosegel oder einem Polyacrylamidgel aufgetrennt
(Abb.
9.4
). Die Größe der im Gel bestimmten Fragmente kann allerdings durch die
unterschiedliche Mobilität im Gel um 10-20 % von den tatsächlichen Größen ab-
weichen. Als Alternative bietet sich das Verfahren der Fluoreszenzmarkierung der
PCR-Produkte während der Amplifikation, z. B. durch R110-dCTP, an. Die Frag-
mente lassen sich dann durch die Fluoreszenzmarkierung in einem Sequenzierauto-
maten mit Fragmentanalyse auftrennen.
Für die Analyse einzelner Proben jedoch bietet sich die direkte Sequenzierung
der PCR-Produkte und Datenbankanalyse der Sequenzen an. Der Vorteil besteht vor
allem darin, dass auch unbekannte, bislang nicht als Referenzmaterial vorliegende
Arten bestimmt werden können. Die Sequenzierung erfolgt mit den gleichen Pri-
mern (Abb.
9.5
).
Geschlechtsbestimmung von Säugetieren
Ein Sonderfall der Tierartanalyse ist die Geschlechtsbestimmung. Diese Methode
kann zur Überprüfung der Identität von Fleisch verwendet werden, die Kenn-
zeichnung der Handelsklasse bei Rindfleisch schließt die Geschlechtsangabe ein.
Die Primer sind in konservierten Regionen des Zinc-finger-protein-(ZF-)X-(X-
chromosomal)- und ZFY-(Y-chromosomal)-Genes lokalisiert [
1
]. Die Differen-
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