Molekularbiologische Speziesdifferenzierung - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 133

se bedürfen einer sorgfältigen Interpretation, um nicht aufgrund zufälliger oder
technisch unvermeidbarer Spuren zu falschen Ergebnissen zu kommen. Trotz der
teilweise hohen Spezifität der Verfahren ist die molekularbiologische, sequenz-
spezifische Bestätigungsreaktion positiver PCR-Ergebnisse erforderlich. Negative
Befunde müssen durch eine Amplifikationskontrolle abgesichert werden. Dafür
werden universelle mitochondriale Systeme, zum Beispiel das Cytochrom-b-Sys-
tem oder Primer-Systeme, welche mit über die gesamte taxonomische Klasse oder
gar im gesamten Tier- bzw. Pflanzenreich konservierten Sequenzen hybridisieren,
angewandt.
Methoden auf Basis von mitochondrialen Sequenzen [ 8 , 24 ] und Methoden, die
chromosomale Gensequenzen amplifizieren [ 23 , 25 ], werden als konventionelle
PCR angewandt.
Das Verfahren nach Matsunaga et al. [ 24 ] basiert auf der Amplifikation des Cy-
tochrom-b-Gens mit einem universellen Vorwärtsprimer und mehreren, für die Tier-
arten Rind, Schwein, Schaf, Ziege, Pferd und Huhn spezifischen, reversen Primern.
Diese Methode wurde als Multiplex-PCR entwickelt und kann bei sehr guter Quali-
tät der Oligonukleotide auch als Multiplex-PCR eingesetzt werden. Beachtet wer-
den muss, dass die PCR-Produkte trotz der verschiedenen Größen noch verifiziert
werden müssen; darin besteht gleichzeitig die Grenze der Methode: Eine valide
Verifizierung der Multiplex-PCR durch RFLP ist nur sehr schwierig zu etablieren,
wenn mehrere Spezies im Erzeugnis präsent sind. Die Restriktionsfragmente einer
Spezies können durch ein nichtgeschnittenes, kürzeres PCR-Produkt einer weiteren
Spezies maskiert werden. Ebenso schwierig ist die DNA-Sequenzierung bei Ge-
mischen anzuwenden, denn die zu analysierenden Banden müssen aus dem Gel
extrahiert werden.
In der amtlichen Sammlung wird ein Verfahren zum Nachweis von Pferd, basie-
rend auf mitochondrialen Sequenzen, beschrieben. Dieses PCR-RFLP-Verfahren ist
aufgrund der relativ kurzen Fragmentlänge von 146 bp breit einsetzbar und auch für
Vollkonserven geeignet [ 8 ].
Die spezifische PCR in chromosomalen Genabschnitten bietet die Vorteile einer
hohen Spezifität, verbunden mit einfachen Verifizierungsmöglichkeiten und der
Verwendung kurzer Gensequenzen und somit kurzer PCR-Produkte. Kurze Sequen-
zen sind bei verarbeiteten Erzeugnissen zu bevorzugen, da die DNA aufgrund der
Temperatureinwirkungen, verbunden meist mit einer Absenkung des pH-Wertes,
zu relativ kurzen Fragmenten zwischen etwa 50 und 500 bp hydrolysiert wird. Mit
dem spezifischen System für Rind und Schaf können Anteile von deutlich unter 1 %
sicher nachgewiesen werden, die Größe des PCR-Produktes gestattet die Verifizie-
rung durch RFLP (Abb. 9.4 ).
Speziesbestimmung bei Fischen
Die molekularbiologische Speziesbestimmung bei Fischen erfolgt mit ähnlichen
Systemen wie in der Speziesbestimmung von Säugetieren und Vögeln, es wer-
den ebenfalls mitochondriale Sequenzen amplifiziert und anschließend analysiert
[ 5 , 34 ].