Molekularbiologische Speziesdifferenzierung - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 128

Kontrollreaktionen

In Anlehnung an europäische Normen [ 6 , 7 ] werden folgende Kontrollen einge-
setzt, um eventuelle Kontaminationen zu erkennen:

• Reagenzienkontrolle,

• Extraktionsnegativkontrolle,

• Positivkontrolle und

• Amplifikationskontrolle.

Eine Reagenzienkontrolle steht am Beginn jeder Serie. In dieser Kontrolle befindet
sich nur der PCR-Master-Mix, diese Kontrolle wird unmittelbar nach dem Einfüllen
des Master-Mixes verschlossen. Mit der Reagenzienkontrolle werden gegebenen-
falls Kontaminationen von Primern, Enzymen, Nukleotiden und Puffern erkannt.
In regelmäßigen Abständen zwischen den Proben und am Ende jeder Extrak-
tionsserie werden Extraktionsnegativkontrollen mitgeführt. Durch diese Kontrolle
ist die korrekte Durchführung der DNA-Extraktion nachvollziehbar.
Mit einer Positivkontrolle wird nachgewiesen, dass der Reaktionsansatz korrekt
zusammengefügt worden ist. Die Art der verwendeten Positivkontrolle richtet sich
nach dem Ziel der Untersuchung:

• Dient die Untersuchung dazu, in einheitlichem Material, wie einem Stück Mus-

kelfleisch oder einem ganzen Fisch, die Spezies zu bestimmen, so genügt es, die
vermutete Zielspezies als Positivkontrolle einzusetzen.

• Ist bei Nachweis in solch einheitlichem Material die Zielspezies nicht verfügbar

und wird die Speziesdifferenzierung durch DNA-Sequenzierung vorgenommen,
so ist als Positivkontrolle eine Art der gleichen taxonomischen Klasse ausrei-
chend.

• Bei Nachweis der Zielspezies in zusammengesetzten Lebensmitteln, zum Bei-

spiel von Rind in einer lediglich aus Schweinefleisch hergestellten Wurst oder
umgekehrt, so wird als Positivkontrolle die Zielspezies in einem Gehalt einge-
setzt, der der nachzuweisenden Mindestkonzentration entspricht (etwa 1 % des
verwendeten Ausgangsmaterials). Diese quantitative Positivkontrolle ermöglicht
die Bewertung des konkreten Reaktionsansatzes hinsichtlich der Sensitivität, da
die Sensitivität durch Qualitätsunterschiede von Reagenzien, den Einfluss der
Lagerung auf Reagenzien oder durch unvermeidbare Pipettierungenauigkeiten
durchaus schwanken kann.

Neben dem Ausschluss falsch positiver Ergebnisse durch mitgeführte Extraktions-
negativkontrollen und die Reagenzienkontrolle ist das Vermeiden falsch-negativer
Ergebnisse ebenso wichtig, diese können durch Amplifikationskontrollen ausge-
schlossen werden. Durch Amplifikationskontrollen kann die Amplifizierbarkeit
der extrahierten DNA jeder Probe überprüft werden. Als Amplifikationskontrolle
ist eine universelle PCR, bei der eine Vielzahl an Organismen erfasst wird, gut
anzuwenden. Die PCR-Produkte einer Amplifikationskontrolle müssen gleichlang
oder länger als jene der eigentlichen Nachweisreaktion sein, um den Grad der Frag-
mentierung der DNA in Lebensmitteln und dessen Einfluss auf das Untersuchungs-
ergebnis zu überwachen.