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Das Verfahren ist relativ aufwendig: Die extrahierte DNA wird mittels Slot Blot
an einen Membranfilter fixiert und anschließend mit der Sondenlösung hybridisiert.
Die Sonden sind Digoxygenin-(DIG-)markiert, hybridisierte Sonden werden durch
einen Anti-DIG-Alkalische-Phosphatase-(AP-)Konjugat nachgewiesen. Die Sicht-
barmachung kann durch Farbreaktion oder durch die sensitivere, aber noch auf-
wendigere Chemilumineszenz-Detektion erfolgen. Der Vorteil der direkten Hybri-
disierung besteht darin, dass die Sensitivität des Verfahrens dahingehend eingestellt
werden kann, falsch-positive Signale durch nichtrelevante Spuren zu vermeiden.
Allerdings findet aufgrund des hohen Aufwandes heute eine Routineanwendung
nicht statt.
9.2.3
Speziesnachweis durch Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion ist derzeit die Methode der Wahl zur Speziesbe-
stimmung. Sie ist schnell, sensitiv und spezifisch. Nachstehend werden einige der
am weitesten verbreiteten Verfahren vorgestellt.
9.2.3.1
Qualitätssicherung der PCR-basierten Speziesdiagnostik
Die hohe Empfindlichkeit der PCR verlangt nach einem vergleichsweise sehr ho-
hen Aufwand qualitätssichernder Maßnahmen. Während in der in anderen moleku-
larbiologischen Arbeitsbereichen, genannt sei vor allem die molekularbiologische
Diagnostik pathogener Mikroorganismen, in der Regel davon auszugehen ist, dass
der Zielorganismus nicht in der Umgebung und vergleichsweise selten im Unter-
suchungsmaterial vorkommt, sind bei der Speziesdiagnostik potenzielle Zielse-
quenzen nahezu immer präsent. Mit speziellen Maßnahmen der Qualitätssicherung
in der PCR zum Speziesnachweis muss eine Kontamination des Probenmaterials,
der Reagenzien und der Reaktionsansätze durch die nahezu omnipräsente humane
DNA, aber auch DNA weiterer in der Umgebung vorkommender Organismen, ver-
mieden werden; hat eine Kontamination stattgefunden, so muss diese sofort erkannt
werden. Bereits bei der DNA-Extraktion muss jeglicher Kontakt des Untersuchers
mit dem Probenmaterial vermieden werden. Die Instrumente zum Zerkleinern des
Probenmaterials müssen steril und nahezu DNA-frei sein. Einweginstrumente sind
zu bevorzugen, es können jedoch auch Edelstahlpinzetten, -scheren und -skalpelle
verwendet werden, wenn diese nach den Arbeiten gründlich gereinigt und durch
Behandeln mit Natriumhypochlorit-Lösung (z. B. Haushaltsreiniger Klorix
®
) DNA-
frei gemacht werden. Da Reste der Natriumhypochlorit-Lösung die enzymatischen
Reaktionen inhibieren, wird anschließend das Material gründlich gespült sowie
heißluftsterilisiert. Die Herstellung von Puffern muss so erfolgen, dass kein DNA-
Eintrag erfolgen kann, z. B. durch die Messelektrode des pH-Meters. Schließlich
verhindert die personelle Trennung der Arbeitsbereiche vor und nach der Ampli-
fikation ein Verschleppen von Reaktionsprodukten.
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