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die CTAB-Extraktion als Standard für die Effizienz und Qualität der DNA-Extrak-
tion aus den meisten Lebensmitteln gelten.
9.2.2
Tierartnachweis durch direkte DNA-Hybridisierung mit
spezifischen Sonden
Die direkte Hybridisierung wird zum Nachweis von Tierarten in Fleischerzeugnis-
sen angewandt. Sie basiert auf der Bindung von tierartspezifischen Sonden an die
Ziel-DNA. Die markierten Sonden hybridisieren an repetitiven DNA-Sequenzen,
die mehrfach im Genom vorkommen. Dadurch sind diese Verfahren recht sensitiv
und spezifisch.
Die aus dem Probenmaterial gewonnene DNA wird entweder elektrophoretisch
aufgetrennt und an eine Membran gebunden oder direkt nach Slot-Blot auf eine
entsprechende Membran transferiert. Die Hybridisierung erfolgt durch Southern-
Blot. Nach Absättigung unspezifischer Bindungsstellen wird eine Lösung mit den
spezifischen Sonden auf die Membran aufgebracht und bei einer vorab bestimmten
Temperatur hybridisiert. Die Hybridisierungstemperatur ist von der DNA-Sequenz
sowie der Länge der Sonde abhängig. Zur orientierenden Bestimmung der Hybri-
disierungstemperatur bei Oligonukleotid-Sonden (und PCR-Primern) ist die 2 + 4-
Grad-Regel geeignet: Pro A oder T wird ein Temperaturwert von 2 °C festgelegt,
pro C oder G ein Temperaturwert von 4 °C. Die Summe der Anzahl der Basen, mul-
tipliziert mit den Temperaturwerten, ergibt die Hybridisierungstemperatur. Besteht
eine Sonde zum Beispiel aus 20 Basen, welche jeweils 5 A, T, C und G umfassen,
ergibt dies eine Hybidisierungstemperatur von
T
=
5(
A
)
×
2
+
5(
T
)
×
2
+
5(
C
)
×
4
+
5(
G
)
×
4
=
60
◦
C
.
Ausgehend von dieser Überschlagsrechnung muss die optimale Hybridisierungs-
temperatur experimentell bestimmt werden. Zunächst wird DNA der entsprechen-
den Tierarten in reiner Form mit der zu prüfenden Sonde analysiert. Dabei wird der
Temperaturbereich bestimmt, innerhalb dessen nur die Zielspezies ein Signal er-
gibt. Anschließend werden relevante Gemische aus Fleisch der Zielspezies in unter-
schiedlichen Äquivalenten analysiert.
Zur Sondenmarkierung können mehrere verschiedene Systeme angewandt wer-
den. Zu Beginn der Anwendung des Southern Blot wurde häufig mit radioaktiv
markierten Sonden gearbeitet. Durch die Erfordernisse der Routineanalytik hat sich
die Markierung mit Dioxigenin weitgehend durchgesetzt. Das Glycosid Digoxige-
nin wirkt als Antigen und kann damit durch eine immunologische Nachweisreak-
tion detektiert werden. Als konjugierte Antikörper werden enzymmarkierte Syste-
me oder Chemilumineszenz-basierte Systeme eingesetzt. In dem Verfahren nach
Rüggeberg et al. [
29
] kommen spezifische Sonden zum Einsatz, die an repetitive
DNA-Elemente der jeweiligen Tierarten bei einer Nachweisgrenze von 1 % hyb-
ridisieren.
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