Molekularbiologische Speziesdifferenzierung - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 125

Verfahren, die auf universellen Zielsequenzen basieren; mit den gleichen Oligonuk-
leotiden werden mehrere Tier- und Pflanzenarten simultan nachgewiesen. Durch
Kompetition der Oligonukleotide um die Hybridisierungsstellen der Zielsequenzen
werden lediglich jene Arten ein positives Signal erzeugen, deren DNA-Anteil in der
Probe einen bestimmten Schwellenwert überschreitet.

9.2.1 DNA-Extraktion

Eine effiziente DNA-Extraktion ist die Grundlage für die molekularbiologische
Speziesdifferenzierung. Die Zahl der beschriebenen DNA-Extraktionsverfahren
und kommerziellen Kit-Systeme ist hoch. Damit ist der Anwender einer gewissen
Unsicherheit ausgesetzt, welches System bei den Routineanalysen anzuwenden ist.
Je stärker verarbeitet ein Erzeugnis ist, je höhere Temperaturen oder Drücke wäh-
rend der Herstellung angewandt wurden, je niedriger der pH-Wert ist, umso gerin-
ger wird der Anteil amplifizierbarer DNA im Erzeugnis selbst sein. Dies stellt bei
einigen hoch prozessierten Erzeugnissen hohe Anforderungen an die Effizienz der
Verfahren zur DNA-Extraktion.
Im Rahmen der Probenvorbereitung ist zunächst eine sorgfältige Auswahl des
Untersuchungsmaterials zu treffen. Gegebenenfalls werden Wursthüllen entfernt
und die verschiedenen Bestandteile des Erzeugnisses präpariert, sofern eine dif-
ferenzierte Untersuchung erforderlich scheint. Schieres Muskelfleisch kann direkt
verwendet werden, es ist die entsprechende Probenmenge aus dem Inneren des zu
analysierenden Stückes zu entnehmen. Bei der Mehrzahl der Proben ist eine Homo-
genisierung erforderlich, die Probenmenge zur Homogenisierung sollte 100 g nicht
unterschreiten. Nicht homogenisiert werden sehr fein zerkleinerte und bereits homo-
gen erscheinende Lebensmittel wie fein zerkleinerte Brühwürste oder bestimmte
Backwaren. Bei solchen Erzeugnissen führt die Herstellungstechnologie bereits zu
einer gründlichen Durchmischung.
Als universelles System der DNA-Extraktion aus Lebensmitteln tierischer Her-
kunft und aus pflanzlichen Lebensmitteln hat sich die CTAB-Extraktion bewährt,
modifiziert durch Zusatz von Proteinase K zur Unterstützung der Lysis des Proben-
materials und Verlängerung der Zeit für die Lysis des Materials auf 12 bis 18 h. Ent-
scheidend für die DNA-Ausbeute ist eine nahezu vollständige Lysis des Materials.
Trübner [ 33 ] hat in Versuchen zur Optimierung festgestellt, dass die besten Ergeb-
nisse bei einer Inkubationstemperatur von 65 °C unter Zusatz von 10 µl Proteina-
se K zu 200 mg fein zerkleinerten Probenmaterials erzielt werden. Weitere Reini-
gungsschritte sind bei den meisten Erzeugnissen nach der CTAB-Extraktion nicht
erforderlich. Der Nachteil des beschriebenen Verfahrens liegt in der Verwendung
von Chloroform als gesundheitsschädliches organisches Lösungsmittel einerseits
sowie in dem hohen Arbeitsaufwand andererseits. Die Methode ist nicht automati-
sierbar, für einen hohen Probendurchsatz ist sie kaum geeignet.
Werden kommerzielle Kit-Systeme eingesetzt, so sollten diese eine Extraktions-
effizienz aufweisen, die jener der CTAB-Extraktion vergleichbar ist. Damit kann