Molekularbiologische Methoden zum Nachweis lebensmittelübertragbarer Viren - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 116

mindestens 3 min ausgewaschen und sorgfältig ausgepresst. Dies ist der wesent-
liche Schritt der Methode. Der Vorteil der Probennahme mittels Tupfer liegt darin
begründet, dass der Eintrag inhibierender Komponenten der Lebensmittelmatrix
minimiert wird. Zur RNA-Extraktion können kommerzielle Kits eingesetzt werden.
Nach der Viruslyse wird die RNA an eine Silika-Matrix gebunden und anschließend
eluiert. Der Nachweis der Norovirus-spezifischen Nukleinsäuresequenzen erfolgt
nach reverser Transkription mittels „one-step real-time RT-PCR“.
Aufgrund der Heterogenität und Variabilität der Noroviren ist es erforderlich,
Primer und/oder Sondensequenzen an die Population zirkulierender Virusstäm-
me anzupassen. Exemplarisch werden in der Methode der Amtlichen Sammlung
folgende Primer-Sondensysteme aufgeführt: Höhne und Schreier [ 25 ]; Kageyama
et al. [ 60 ]; Pusch et al. [ 61 ]; Dreier et al. [ 62 ]; Höhne und Schreier [ 63 ].
Dreier et al. beschreiben, dass durch den Einsatz von LNA-Sonden zum Nach-
weis von Norovirus GGII in Stuhlproben und Lebensmitteln die Sensitivität der
Nachweis-Reaktion im Vergleich zu konventionellen Hydrolyse-Sonden entschei-
dend verbessert werden konnte [ 62 ]. Als Prozesskontrolle wird der Phage MS2 ver-
wendet [ 64 ]. Durch die Mitführung einer Prozesskontrolle wird ggf. eine Inhibition
erkannt sowie die Effizienz der RNA-Extraktion überprüft. Das Verfahren wurde an
Paprikaschoten, Bockwurst und Muscheln validiert.
Butot et al. beschreiben eine sensitive Methode zum Nachweis von HAV, Noro-
virus und Rotavirus in frischen und gefrorenen Früchten (Brombeeren, Himbeeren,
Erdbeeren), frischem Gemüse (Frühlingszwiebeln, Salat) sowie Basilikum, Minze
und Petersilie, bei der die Viren von der Produktoberfläche schonend abgewaschen,
mittels Ultrafiltration konzentriert und real-time RT-PCR nachgewiesen wurden
[ 32 ]. Zur Inaktivierung von PCR Inhibitoren bei der Bearbeitung von Beerenfrüch-
ten wurde eine Pektinase eingesetzt.

8.3.7 NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)

Die NASBA-Methode basiert auf dem Prinzip der Amplifizierung von einzelsträn-
gigen RNA-Transkripten mittels einer T7-RNA-Polymerase mit anschießender De-
tektierung des Produkts durch eine spezifische Oligonukleotid-Sonde. Eine NAS-
BA-Standardreaktion beinhaltet außerdem RNase H, Reverse Transkriptase (RT),
Nukleotide, Desoxynukleotide und ein spezifisches Primerpaar mit einer angehäng-
ten Sequenz des T7-RNA-Polymerase-Promotors. In einer typischen NASBA-Re-
aktion bindet Primer 1 an die komplementäre Region der Ziel-RNA, wobei das
5′-Ende mit der Sequenz des T7-RNA-Polymerase-Promotors nicht bindet und
von der RNA absteht. Anschließend erfolgt die cDNA-Synthese durch die Reverse
Transkriptase. Die RNase H degradiert die RNA-Matrize, Primer 2 bindet an die
verbliebene einzelsträngige cDNA und die RT verlängert den Primer in die Gegen-
richtung. Die T7-Polymerase bindet an den T7-Promotor und generiert zahlreiche
RNA-Transkripte, welche wieder in den fortgesetzten Zyklus aus cDNA-Synthese,
RNase H-Verdau, Zweitstrang-Synthese und RNA-Transkript-Synthese einfließen.