Molekularbiologische Methoden zum Nachweis lebensmittelübertragbarer Viren - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 115

amplifiziert wird, mit der zusätzlichen Option der Quantifizierung [ 55 ]. Die Quan-
tifizierung erfolgt mittels Fluoreszenz-Messung durch Detektion und Quantifizie-
rung eines fluoreszierenden Reporters (DNA-Farbstoffe oder sequenzspezifische
Sondensysteme) während der PCR-Amplifikation in Echtzeit ( real-time ). Für jede
Probe laufen die Prozesse von Amplifikation, Detektion und Quantifizierung des
Reaktionsproduktes in jedem Zyklus automatisiert ab. In einer real-time PCR kann
entweder als Template DNA oder RNA (real-time RT-PCR) eingesetzt werden. Bei
Einsatz von RNA muss diese in einem ersten Schritt durch eine Reverse Transkrip-
tase in cDNA umgeschrieben werden.
Eine Methode zur Detektion und Quantifizierung von PCR-Produkten in real-
time PCR-Reaktionen ist die Verwendung von interkalierenden DNA-Farbstoffen.
SYBR Green ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der in Lösung relativ wenig Fluoreszenz
zeigt. Dieser interkaliert in doppelsträngige DNA-Moleküle und emittiert in dieser
Form ein starkes Fluoreszenzsignal. Wenn im Verlauf der Reaktion das PCR-Pro-
dukt akkumuliert, steigt die Zunahme der Fluoreszenz proportional an. Die Vorteile
dieses Farbstoffs sind neben der Kosteneffizienz die einfache Handhabbarkeit und
Sensitivität. Die Nachteile liegen in der kaum vorhandenen Spezifität (es bindet
jede dsDNA inklusive Primer-Dimere und unspezifische Amplifikate) und der feh-
lenden Möglichkeit für Multiplex-PCR.
Die spezifische Detektion von PCR-Produkten wird durch den Einsatz sequenz-
spezifischer Fluoreszenzsonden ermöglicht, die nach dem Prinzip des „fluorescence
resonance energy transfer“ (FRET) funktionieren und ebenfalls Fluoreszenzsignale
generieren [ 56 , 57 ]. Ein Donor-Fluorophor (Reporter), das durch eine Energiequelle
(Licht) angeregt wird, gibt einen Teil seiner Energie an ein in ausreichender Distanz
befindliches Akzeptor-Fluorophor (bzw. einen Quencher) ab. Vergrößert sich die
Distanz zwischen Donor und Akzeptor, so nimmt der FRET und somit die Intensi-
tät des Akzeptor-Fluoreszenzsignals ab, während die des Donors zunimmt. Neben
einfachen FRET-Hybridisierungssonden finden u. a. Hydrolyse-Sonden TaqMan,
Molecular Beacons und Scorpion-Sondensysteme in der real-time RT-PCR Anwen-
dung. Die LNA-Sonden sind Varianten von Hydrolyse-Sonden, die modifizierte
Nukleotide, sog. LNAs (Locked-Nucleid-Acids) enthalten [ 58 ]. Die LNA-Sonden
binden komplementäre Sequenzen fester, sodass kürzere Sondensequenzen ausrei-
chend sind, was beim Sondendesign für problematische Sequenzbereiche vorteilhaft
ist. Ebenso erhöht das Einfügen von LNA-Nukleotiden die Hybridisierungsaffinität
und verringert die Schmelztemperatur, was eine bessere Sequenzspezifität und eine
Verringerung des Fluoreszenz-Backgrounds bewirken kann [ 59 ].
Nachfolgend wird exemplarisch das auf nationaler Ebene in der Amtlichen
Sammlung nach § 64 LFGB unter der Nummer L 00.00-112:2007-12 veröffent-
lichte Verfahren „Qualitativer Nachweis von Norovirus der Genogruppe I und II
auf glatten, festen Oberflächen von Lebensmitteln durch real-time RT-PCR“ vor-
gestellt.
Das Verfahren beschreibt den qualitativen Nachweis von Norovirus in durch Ab-
tupfern von glatten, festen Lebensmitteloberflächen gewonnenen Tupferproben mit-
tels RT-PCR. Die Probennahme erfolgt mit angefeuchteten Tupfern, indem die zu
untersuchende Oberfläche intensiv beprobt wird. Die Tupfer werden in Lysepuffer