Molekularbiologische Methoden zum Nachweis lebensmittelübertragbarer Viren - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 114

8.3.5 AC/IM RT-PCR (Antigen-Capture/Immunomagnetic

beads RT-PCR)

Effiziente Methoden zum Nachweis von Viren sind die Antigen-Capture PCR (AC
RT-PCR) und die „immunomagnetic beads“ RT-PCR (IM RT-PCR). Diese beruhen
auf einer Separation von Viren mittels monoklonaler Antikörper, die an Oberflächen
von Reaktionsgefäßen (AC RT-PCR) oder paramagnetischen Teilchen „magnetic
beads“ gekoppelt werden. Vorteil dieser Methode ist neben der Aufkonzentrierung
die Entfernung/Reduzierung inhibitorischer Substanzen, die die PCR stören.
Deng et al. beschreiben die AC RT-PCR zum Nachweis von HAV u. a. in Aus-
tern und Muscheln [ 28 ]. Dazu wurden sterile Polypropylen-Reaktionsgefäße mit
anti-HAV IgG beschichtet. HAV-haltige Muschel/Austern-Proben werden über
Nacht bei 4 °C inkubiert und die an AK-gebundenen Viruspartikel mittels RT-PCR
detektiert.
Die IM RT-PCR wurde zum Nachweis von unterschiedlichen lebensmittelas-
soziierten Viren aus diversen Matrizes erfolgreich eingesetzt, z. B. HAV auf Früh-
lingszwiebeln und Erdbeeren [ 48 ]; HAV aus Wasser/Abwasser [ 49 ]; Norovirus aus
Lebensmitteln [ 50 ]; Enteroviren, HAV und Rotavirus aus Abwasser [ 51 ]; Norovirus
GGI in artifiziell kontaminierten Wasserproben [ 52 ]; Enterovirus, HAV und Noro-
virus in Muscheln [ 53 ].
Shan et al. setzten im Rahmen der Virusisolierung von Frühlingszwiebeln und
Erdbeeren mit Streptavidin gecoatete beads ein, an die biotinylierte, monoklonale
Antikörper gegen HAV gekoppelt wurden [ 48 ]. In Vergleichsuntersuchungen konnte
gezeigt werden, dass im Waschwasser von Frühlingszwiebeln und Erdbeeren beim
Einsatz „immunomagnetischer beads“ die Sensitivität um das 10fache gegenüber
einer Bearbeitung ohne immunomagnetische beads gesteigert werden konnte.
Bidawid et al. beschreiben die F-IM-PCR, eine Kombination aus IM-PCR und
Filtration mit positiv geladenen Filtern (F), zur Isolierung, Aufkonzentrierung und
schnellen Detektion von Hepatitis A-Viren aus artifiziell kontaminierten Proben
wie Salat und Erdbeeren [ 54 ]. Bei diesem Verfahren werden zunächst die Hepatitis
A-Viren an einem positiv geladenen Virosorb-Filter adsorbiert. Die anschließend
vom Filter eluierten HAV werden unter Zugabe von immunomagnetischen beads
isoliert und mittels RT-PCR nachgewiesen. An immunomagnetic beads gekoppelte
Viren können zum Nachweis direkt in einer RT-PCR oder nested PCR eingesetzt
werden. Im Vergleich zur IM-PCR erlaubt die F-IM-PCR die spezifische Aufkon-
zentrierung von Viren und eignet sich demnach gut zum Nachweis von geringen
Viruszahlen in größeren Volumina.

8.3.6 Real-time PCR/real-time RT-PCR

Die real-time PCR beruht auf dem Prinzip der konventionellen PCR (Polymera-
se Kettenreaktion), bei der eine DNA-Sequenz spezifisch mit einem Primerpaar