Molekularbiologische Methoden zum Nachweis lebensmittelübertragbarer Viren - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 113

weiteren Reaktion mit einem weiteren Primerpaar, das an Sequenzbereiche inner-
halb dieser Matrize bindet (nested Primer), ein kürzeres DNA-Fragment amplifi-
ziert. Da für das nested PCR-Produkt lediglich das Produkt der ersten Amplifika-
tion als Matrize dient, ist hierbei der Vorteil gegenüber der konventionellen PCR
die höhere Spezifität (verringerter Background, verursacht durch nichtspezifischee
Amplifikation) und Sensitivität. Ist das zu amplifizierende Target Ribonukleinsäure
(z. B. beim Nachweis von RNA-Viren), wird vor der nested-PCR ein zusätzlicher
Schritt durchgeführt, bei dem die RNA von einer Reversen Transkriptase zunächst
in cDNA umgeschrieben wird.
Schultz et al. wiesen Norovirus GII im Hepatopankreas von artifiziell kontami-
nierten Austern ( Crassostrea gigas und Ostrea edulis ) nach [ 39 ]. Unter Verwendung
unterschiedlicher Aufarbeitungsprotokolle, RT-single PCR [ 40 , 41 ] und seminested
RT-PCR [ 42 , 43 ] konnte gezeigt werden, dass eine in einer Zellmühle homogeni-
sierte Probe nach RNA-Extraktion in Verbindung mit der seminested RT-PCR die
beste Wiederfindung ergab.
Jothikumar et al. wiesen Norovirus im Hepatopankreas in natürlich kontaminier-
ten Muscheln mittels nested „two step“ RT-PCR nach [ 44 ]. Von der nested RT-PCR
sind Variationen als Multiplex-Ansatz zum Nachweis von Adenoviren, Enteroviren
und HAV in verschiedenen Umweltproben, z. B. in Abwasser und Schalentieren
sowie zur Diagnose von viralen Gastroenteritiden beschrieben [ 38 , 45 ].

8.3.4 ICC-PCR (Integrated Cell Culture-PCR)

Die Integrated Cell Culture-PCR (ICC-PCR) kombiniert die schnelle Durchführ-
barkeit und Sensitivität der RT-PCR mit der Zellkultur-Technik und ermöglicht eine
sensitive und zeitsparende Identifizierung infektiöser Viruspartikel. Die ICC-PCR
umfasst zunächst die Inokulation und Inkubation eines Zellkultur-Monolayers mit
konzentriertem Probenmaterial. Anschließend wird das Zelllysat mittels RT-PCR
analysiert. Detektiert werden Viren mit und ohne Ausbildung eines cytopathischen
Effektes.
Von den lebensmittelübertragbaren Viren können Poliovirus, Adenovirus, Ente-
rovirus, Hepatitis A-Virus und Rotavirus mittels Zellkultur nachgewiesen werden.
Reynolds et al. setzten die Methode zum Nachweis von Enterovirus und HAV ein
[ 46 ]. Die Studie zeigt, dass die RT-PCR oder die konventionelle Zellkultur alleine
fehlerhafte Ergebnisse bei der Untersuchung von Umweltproben wie Trinkwasser,
Meerwasser und Meeresfrüchten liefert. Während elf Proben mittels ICC-PCR En-
terovirus positiv getestet wurden, sind mittels RT-PCR nur in drei Proben Entero-
viren nachgewiesen worden. Greening et al. setzten die Methode zur Detektion von
Enteroviren in Umgebungsproben ein [ 47 ]. Croci et al. benutzen die Technik zum
Nachweis von HAV in Muscheln ( Mytilus galloprovincialis ) [ 17 ]. Von 180 mittels
nested RT-PCR untersuchten Proben wurden 15,6 % HAV positiv getestet. Zur Be-
stätigung der Infektiösität wurde von den positiven Proben eine ICC-PCR durch-
geführt.