Molekularbiologische Methoden zum Nachweis lebensmittelübertragbarer Viren - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 112

Methoden der Molekularbiologie: Reverse Transkription und PCR. RNA wird in
einem ersten Schritt in cDNA durch die Reverse Transkriptase umgeschrieben. An-
schließend erfolgt in einem zweiten Schritt die Amplifikation der cDNA mittels
Gen-spezifischer Primer. Dabei kann die Reaktion entweder getrennt als Zwei-
Schritt-RT-PCR durchgeführt werden, bei der zunächst die RNA in cDNA umge-
schrieben wird und diese anschließend in einem getrennten Reaktionsansatz als
Template in einer PCR mit sequenzspezifischen Primern eingesetzt wird (Nachteil:
mögliche Kontamination der Probe mit RNasen oder Fremd-Nukleinsäuren/Vorteil:
im Allgemeinen sensitiver, cDNA-Ausbeute ausreichend für mehrere PCRs) oder
als Ein-Schritt-RT-PCR ablaufen, bei der die spezifischen Primer in dem gleichen
Ansatz mit der RT genutzt werden und beide Reaktionen (reverse Transkription und
die Amplifikation) hintereinander im selben Gefäß ausgeführt werden.
Der Nachweis von Norovirus in Lebensmitteln mittels RT-PCR wird z. B. von
Phan et al. in Austern [ 33 ] und von Le Guyader et al. in Himbeeren beschrieben [ 13 ].
Chancellor et al. beschrieben den Nachweis von HAV in Frühlingszwiebeln [ 34 ].

8.3.2 mRT-PCR (multiplex RT-PCR)

Bei der Multiplex-PCR finden mehrere Primerpaare mit Spezifität für unterschied-
liche DNA-Regionen im selben Ansatz Verwendung. Es werden dabei Amplikons
unterschiedlicher Größe und von unterschiedlichen DNA-Regionen oder Genomen
gleichzeitig generiert, deren Einzelnachweis ein Vielfaches an Reagenzien und Zeit
erfordert. Beuret entwickelte eine Multiplex-RT-PCR mit hoher Sensitivität zum
Nachweis von Norovirus GI und GII, Astrovirus und Enterovirus [ 35 ]. Phan et al.
wiesen mit dieser Technik Enteroviren, HAV, HEV und Influenza A in Stuhlproben
nach und Wolf et al. detektierten ein Spektrum unterschiedlicher Norovirus-Geno-
gruppen in verschiedenen Matrizes (Stuhlproben, behandeltes und unbehandeltes
Abwasser, Quellwasser und Trinkwasser) [ 36 , 37 ]. Formiga-Cruz et al. entwickelten
vor dem Hintergrund, dass Umfeldproben und Muscheln geringe Konzentrationen
verschiedener Viren enthalten können, eine nested Multiplex-RT-PCR zum Nach-
weis von Adenovirus, Enterovirus und HAV [ 38 ]. Die Multiplex-RT-PCR wurde da-
hingehend optimiert, die drei genannten Viren simultan nachzuweisen, auch wenn
jeweils weniger als 1000 Kopien vorlagen.

8.3.3 Nested RT-PCR

In der nested (=geschachtelten) PCR werden zwei PCR-Reaktionen nacheinander
durchgeführt. Dazu werden zwei verschiedene Primerpaare genutzt. In einer ersten
Reaktion werden mit dem ersten Primerpaar DNA-Produkte generiert, die neben
dem gewünschten Amplikon ebenso aus unspezifisch amplifizierten DNA-Frag-
menten bestehen können. Unter Verwendung dieser DNA-Produkte wird in einer