Pathogene Mikroorganismen - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 102

Das Mitführen einer ZIK wäre für jede einzelne Lebensmittelprobe wünschens-
wert und wird durch die Klonierung eines Target-negativen, aber mit einer künst-
lichen Positivkontrolle versehenen Zielkeims ermöglicht. Ein für die Detektion
von Listeria monocytogenes verwendeter real-time PCR Assay, welcher einen Ab-
schnitt des prfA- Gens amplifiziert, diente als Grundlage für eine ZIK für das Lis-
terien-Quantifizierungssystem. Als Grundlage zur Herstellung einer ZIK diente ein
∆-prfA- Stamm, in welchen mit einem site-specific Phage integration Vector (pPL
2 [ 19 ]) ein künstliches 100 bp Target kloniert wurde. Der fertige Vektor wurde zur
Amplifikation in Escherichia coli transformiert und anschließend durch Elektrop-
orationsprotokoll in den Zielkeim transformiert und mittels einfache Insertion ins
bakterielle Genom integriert.
Dieser ∆-prfA;+IPC L. monocytogenes -ZIK wird zu jeder Probe entweder am
Anfang oder vor den einzelnen Arbeitsschritten gegeben und erlaubt eine durch-
gängige Validierung der analytischen Kette. Dieser Ansatz ermöglicht je nach Auf-
wand eine Prozesskontrolle für das gesamte System oder eine Überwachung jedes
einzelnen Arbeitsschrittes mit gleichzeitiger Bestimmung der Effizienz und somit
der Gewährleistung einer exakten Quantifizierung.

7.5.5 Qualitätssicherung in der molekularbiologischen Analytik

von pathogenen Mikroorganismen

Molekularbiologische Lebensmittelanalytik unterscheidet sich grundsätzlich von
kulturellen Techniken im Hinblick auf die Komplexität der Methodendurchfüh-
rung und der Interpretation des Ergebnisses. Während kulturelle Verfahren in der
Regel einfach in ihrer Durchführung sind und bei Vorliegen der nötigen Erfah-
rung der Keim einer morphologisch oder biochemisch basierten Analyse direkt
zugänglich wird, werden bei Verwendung molekularbiologischer Methoden kom-
plexe Analyten erfasst, aus deren Vorhandensein auf die Präsenz des Zielkeimes
geschlossen wird. Aus diesen Überlegungen ergibt sich, dass diese Verfahren in
der Regel als Screeningmethoden bezeichnet werden und bei positivem Ergebnis
eine Bestätigung mittels einer meist kulturellen Referenzmethode erfolgt. Durch
die Manipulation kleiner Volumina und die komplexe Natur der Assays muss in
der Regel geschultes Personal eingesetzt werden. So wurde bei zwei Ringversu-
chen, an denen 19 europäische Laboratorien teilnahmen, gezeigt, dass zwar alle
in der Lage waren, zehn verschiedene Proben (fünf Yersinia-enterocolitica -Isolate
und fünf Negativkontrollen) qualitativ richtig zu bestimmen, aber bei Vorliegen
eines semi-quantitativen Templates (Konzentrationen eines Plasmids von 15.000,
1500, 1500 und 15 Kopien) die Anzahl der richtigen Ergebnisse mit der verwen-
deten Konzentration an Template abnahm (Abb. 7.3 ). Dies wurde hauptsächlich
auf die fehlende Arbeitsroutine zurückgeführt, da offensichtlich kleine Abwei-
chungen in den analytischen Fertigkeiten des Laborpersonals zu unterschiedlichen
Amplifikationsergebnissen vor allem bei Vorliegen von geringen Konzentrationen
am Template führten.
In einer detaillierten Studie wurde weiters gezeigt, dass die RT-PCR biochemisch
ein robustes System ist, da künstliche Mutationen in Primer- und Sondensequenzen