Pathogene Mikroorganismen - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 101

sobrinus , Micrococcus luteus , Staphylococcus aureus , Pseudomonas syringae ,
Mycobacterium avium und Anoxybacillus flavithermus ein Einfluss von EMA auf
lebende Zellen festgestellt, der bei Serratia marcescens und bei Salmonella typhi-
murium sowie bei einer Vielzahl der oben genannten Bakterienspezies bei der An-
wendung von Propidiumiodid (PMA) als Alternative zu EMA nicht nachgewiesen
werden konnte [ 11 , 25 - 27 , 32 , 33 , 41 , 42 ].
Andere Strategien zur Lebend/tot-Unterscheidung von Bakterien zielen darauf
ab, nur lebende Zellen aus der Probe der PCR-Untersuchung zuzuführen. Zu diesen
Methoden gehören beispielsweise verschiedenste Varianten der Dichtegradienten-
zentrifugation, wobei lebende von toten Bakterien entsprechend ihrer Dichteunter-
schiede getrennt werden sowie der Einsatz von Antikörpern, die selektiv nur le-
bende Bakterien immobilisieren, was am Beispiel L. monocytogenes gezeigt wurde
[ 12 , 20 ].

7.5.4 Kontrollen in der molekularbiologischen Analytik

Diagnostische Systeme bestehen im Regelfall aus einer Kette von aufeinanderfol-
genden Arbeitsschritten von der Probenziehung bis zur Ergebnisbefundung (analy-
tische Kette). Die Verwendung molekularbiologischer Methoden in der Lebensmit-
telüberwachung führt zur Notwendigkeit besonderer Kontrollen, da die chemische
Natur von Lebensmitteln und verwendeten Nährmedien das Vorliegen komplexer
mikrobieller Kommunitäten wie auch die Vielzahl der Arbeitsschritte Fehlermög-
lichkeiten bergen. So besteht eine Real-Time-PCR-Analytik aus zumindest fünf
großen Arbeitsschritten (siehe Abb. 7.2 ). Für jeden dieser Schritte wäre theoretisch
eine positive und eine negative Kontrolle notwendig. In der Praxis ist ein derart
aufwendiges Kontrollsystem nicht durchführbar. Je präziser eine fakultative Fehler-
quelle ausgeschlossen werden soll, umso mehr Kontrollen werden jedoch benötigt.
Da bei den meisten molekularbiologischen Analysen Arbeitsschritte kombiniert
werden, die sowohl Bakterienzellen (Anreicherungen, Lyse) wie auch subzellulä-
re Moleküle (Nukleinsäuren) bearbeiten, wären zelluläre interne Kontrollen (ZIK),
die während des gesamten analytischen Prozesses mitgeführt werden (sogenannte
Prozesskontrollen), vor allem für quantifizierende molekularbiologische Methoden
von großem Vorteil. Die am Institut für Milchhygiene der Veterinärmedizinischen
Universität Wien entwickelte neue Probenvorbereitungsmethode (Matrixlysis) er-
möglicht eine Direktquantifizierung der Zielkeime mittels real-time PCR [ 22 , 31 ].
Prozesskontrollen werden bei diesem System an verschiedenen Stellen benötigt.
Die Trennung der Zielkeime von der Lebensmittelmatrix, der Bakterienaufschluss,
die DNA-Aufreinigung und der Enzymassay real-time PCR sollen in ihrer Effizienz
beurteilt werden. Negativkontrollen zur Gewährung einer kontaminationsfreien
Manipulation müssen durch das Mitführen von Leerkontrollen ohne Sample oder
Standard eingeführt werden. Der abschließende Schritt der real-time PCR lässt sich
mit einem zusätzlichen internen Target („internal positive control“, IPC), welches
häufig eine designte Sequenz darstellt, auf dem die gleichen Primer, jedoch nicht
dieselbe Sonde, binden, überwachen [ 13 ].