Pathogene Mikroorganismen - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 100

7.5.3 Die Lebend/Tot-Problematik beim molekularbiologischen

Nachweis von pathogenen Mikroorganismen

DNA-basierte Nachweis- und Zählungsmethoden von Bakterien waren bis vor Kur-
zem nicht in der Lage, zwischen der DNA von toten und lebenden Bakterien zu
unterscheiden. Bakterielle Erreger von Lebensmittelinfektionen müssen jedoch in
einem vermehrungsfähigen Zustand in den Lebensmitteln vorliegen, um eine Ge-
fährdung des Menschen durch den Konsum des kontaminierten Lebensmittels dar-
zustellen.
Dieses Problem wird umso wichtiger, je mehr das Bestreben in Richtung mo-
lekularbiologischer Zählung von Lebensmittelinfektionserregern direkt aus den
Lebensmitteln geht und RT-PCR dies ermöglicht [ 42 ]. PCR-Methoden wurden bis
jetzt vorwiegend nach einer Anreicherung oder zur Bestätigung von verdächtigen
Kolonien auf Platten herangezogen. Bei diesen Anwendungen steht das Problem
der Lebend/tot-Unterscheidung von Bakterien nicht im Vordergrund, da eine Keim-
vermehrung vor der PCR-Untersuchung stattfindet und tote Bakterien in der Probe
über die Anreicherung verdünnt werden. Dennoch wurden auch nach Anreicherung
falsch-positive PCR-Ergebnisse aufgrund des Nachweises von DNA aus toten Bak-
terien beobachtet [ 29 ]. Weiters wurde gezeigt, dass gestresste Bakterien ebenfalls
zu einer Verfälschung quantitativer Ergebnisse beitragen können [ 36 ].
RNA ist nach dem Zelltod weniger stabil als DNA und wurde daher als Alter-
native zu DNA in PCRs zum Lebendnachweis von Lebensmittelinfektionserregern
eingesetzt [ 8 , 17 ]. Auch wurde eine isothermische RNA-Technologie zum Nach-
weis von pathogenen Mikroorganismen angewandt [ 18 , 39 ]. Je nach RNA-Typ lie-
gen die Halbwertszeiten zwischen mehreren Stunden (rRNA) und einigen Minuten
(mRNA), wobei Unterschiede zwischen Transkripten von verschiedenen Genen
auftreten können [ 18 ]. Auch kann die Position der Primer auf dem Transkript die
Eignung des Assays zum Lebendnachweis beeinflussen, was im Transkript des hlyA -
Gens von L. monocytogenes gezeigt wurde [ 28 ]. Da die Zahl der mRNA-Transkipte
eines Genes in Abhängigkeit des physiologischen Zustands der Zelle schwanken
kann, ist eine Quantifizierung von Bakterien mittels RNA nicht durchführbar [ 25 ].
Aus diesen Gründen ist eine RNA-basierte Methode zum Direktnachweis und vor
allem zur direkten Zählung von Lebensmittelinfektionserregern in Lebensmitteln
problematisch.
Kürzlich wurde der fluoreszierende Farbstoff Ethidiumbromid Monoazid (EMA)
zur Real-Time-PCR-basierten Lebend/tot-Unterscheidung von Bakterien vorge-
schlagen [ 32 ]. Dieser Farbstoff dringt selektiv in Zellen mit geschädigter Zellmem-
bran ein und interkaliert in die DNA. Durch sichtbares Licht kann der Farbstoff
kovalent an die DNA gebunden werden und geht dadurch bei einer nachfolgenden
DNA-Isolierung nicht verloren. Farbstoffgebundene DNA kann von der DNA-Po-
lymerase nicht amplifiziert werden. Allerdings gibt es zu dieser Anwendung wi-
dersprüchliche Daten in der Literatur. So wurde beispielsweise eine Signalreduk-
tion von hitzebehandelten und mit verschiedenen Desinfektionsmitteln versetzten
Listeria monocytogenes, Salmonella, Campylobacter, E. coli und Vibrio vulnificus
gezeigt, jedoch bei L. monocytogenes, Campylobacter spp., E. coli , Streptococcus