Pathogene Mikroorganismen - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 97

7.5 Molekularbiologische Nachweis- und
Quantifizierungssysteme für pathogene
Mikroorganismen

7.5.1 Polymerase-Kettenreaktion: Eine neue Ära in der
mikrobiellen Lebensmittelanalytik?

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode zum spezifischen Nachweis
von DNA- oder (nach Umschreibung in DNA) RNA-Abschnitten. Diese Technik ist
sehr sensitiv, da dabei in einer zyklischen, enzymatischen Reaktion DNA-Abschnit-
te exponentiell vermehrt (= amplifiziert) werden. Nach ihrer Erstbeschreibung Mitte
der 1980er-Jahre wurde sie rasch auch zur Detektion von Lebensmittelpathogenen
eingesetzt. Diese Technik wird als Alternative zu diversen phänotypischen Keim-
identifizierungsverfahren hauptsächlich zur Bestätigung von verdächtigen Kolo-
nien auf Agarplatten oder zur Untersuchung von Anreicherungen eingesetzt und
verkürzt und/oder ergänzt somit den traditionellen mikrobiologischen Nachweis.
Um die Vielzahl an Methoden zu sichten und optimierte PCR-Methoden für einige
der wichtigsten Lebensmittelpathogene zu erstellen, wurde 1999 ein umfassendes
Forschungsprojekt von der Europäischen Union gefördert [ 21 ].
Die real-time PCR ist eine Weiterentwicklung der konventionellen PCR. Bei die-
ser Methode wird das Vorhandensein des spezifischen DNA-Abschnittes in der Pro-
be durch einen Fluoreszenzanstieg sichtbar gemacht. Es werden dabei entweder mit
fluoreszierenden Farbstoffen markierte Sonden oder interkalierende Fluoreszenzfarb-
stoffe verwendet [ 2 ]. Da der Zeitpunkt des Fluoreszenzanstieges während der Analyse
von der Startmenge des spezifischen DNA-Abschnittes abhängt, ist mit dieser Metho-
de auch eine Quantifizierung möglich. Darüber hinaus ist keine weitere Analyse der
Probe nach der PCR erforderlich, um die amplifizierte DNA nachzuweisen, was an-
wenderfreundlich ist und die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von falsch-positiven
Proben durch Carry-Over von amplifiziertem Material verringert. Die real-time PCR
hat in den vergangenen Jahren die konventionelle PCR im Lebensmittelbereich in
deren Bedeutung überholt und bestimmt den Großteil der kommerziell angebotenen
PCR-Kits zum Nachweis von Lebensmittelpathogenen. Zukünftige Forschungspro-
jekte werden sich mit dem Einsatz der Technik zur direkten Quantifizierung von Bak-
terien in Lebensmitteln ohne vorhergehende Anreicherung beschäftigen. Die meisten
Probleme werden bei der Probenvorbereitung zu lösen sein, da die Detektionsseite be-
treffend die real-time PCR alle Anforderungen an eine zeitgemäße Analytik erfüllt.

7.5.2 Nachweis pathogener Mikroorganismen mittel RT-PCR

Eine geradezu häretische Frage ist, ob die neuen molekularbiologischen Techniken
die klassisch-kulturellen Techniken jemals ablösen können. Es ist festzustellen, dass