Pathogene Mikroorganismen - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 96

7.4 Probenvorbereitung

7.4.1 Probleme des Samplings

Kulturelle Nachweisverfahren haben den Anspruch, als horizontale Methoden alle
Lebensmittelmatrizes mit vergleichbarer Nachweiswahrscheinlichkeit bearbei-
ten zu können. Grundsätzlich ist die Analytik aus flüssigen Lebensmitteln (z. B.
Milch) oder flüssigen Probenmatrizes (z. B. Spülproben, Fleischsäften) leichter zu
bewerkstelligen, da die Mikroorganismen in flüssigen Medien eine homogenere
Verteilung aufweisen und die chemische Natur von flüssigen Proben in der Regel
weniger komplex ist. Feste Nahrungsmittel müssen erst in eine flüssigkeitsähnliche
Form übergeführt werden, was in der Regel durch Walken (Stomachern) oder mit
destruktiven mechanischen Hilfen geschieht. Durch diese Verfahren kommt es zu
einer Vergrößerung des Probenvolumens, da die Lebensmittel meist in einem 1:10
Verhältnis mit den Anreicherungsmedien (selektiv oder nicht selektiv) versetzt und
dann bearbeitet werden. Wird eine geeignete Anreicherung vor die weiteren ana-
lytischen Schritte gesetzt, wird der Verdünnungseffekt durch die Vermehrung des
Zielkeims während der Anreicherungsschritte kompensiert. Soll die Probe ohne An-
reicherung molekularbiologisch analysiert werden, müssen in der Regel Bearbei-
tungstechniken verwendet werden, die in der Lage sind, die Zielzellen aus dem
(homogenisierten) Lebensmittel aufzukonzentrieren.

7.4.2 Probengröße und molekularbiologische Analytik

Ein Grundproblem der molekularbiologischen Analytik von Pathogenen ist die Pro-
bengröße, der je nach gesetzlicher Anforderung von 1 bis zu 25 g oder ml eines
Lebensmittels betragen kann. In der Regel werden die Proben 1:10 mit der Vor-
anreicherung verdünnt, was bei einer Probengröße von 25 g in einem Ansatz von
250 ml resultiert. Sollte aus der Voranreicherung eine PCR-Analytik durchgeführt
werden, dann wird in der Regel mit Volumina von <1 ml Anreicherung für die nach-
folgende DNA-Extraktion gearbeitet. Neue miniaturisierte Real-Time-PCR-Verfah-
ren arbeiten mit Nanolitervolumina und potenzieren somit das Problem [ 24 ]. Die
Folge ist, dass die Anreicherung den Keim auf eine Keimzahl vermehren muss, die
ausreicht, um in einem Milliliter Voranreicherung genug Zellen zu haben, die nach
weiterer DNA-Extraktion in einem finalen PCR-Ansatz von etwa 5 µl noch immer
Zielmoleküle in nachweisbarer Anzahl enthält. Je nach Lebensmittel kann es aber
vorkommen, dass die Vermehrung von einem pathogenen Zielkeim nicht genügend
produktiv ist.