Extraktion von DNA - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 32

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Abb. 3.3 Typische DNA-Größenverteilung nach Extraktion mithilfe des Promega Wizard Kits.
Spuren 1-4: unterschiedliche DNA-Extrakte aus Schweinemuskelgewebe; Spuren 5-8: unter-
schiedliche Extraktionen aus Rindermuskelgeweben. Spur 9: DNA Größenmarker

relativ klein war (25 mg), was bei inhomogenen Proben ein Problem darstellt. Nach
unseren Erfahrungen sollte eine analytische Probengröße 1 g nicht unterschreiten.
Es wurde versucht, die Methoden dahingehend zu modifizieren, dass auch grö-
ßere Probenmengen eingesetzt werden können. Das Format des Qiagen Kits erlaubt
eine solche Modifikation nicht. Eine Modifikation des Sigma Kits gelang durch
eine Änderung der Gewebeverdauung im ersten Schritt. Dazu wurden folgende drei
alternative Puffer für die Gewebeverdauung eingesetzt und miteinander verglichen:
CTAB-Proteinase-K-Puffer, FISH-Puffer und Wizard-Magnet-Kit-Verdauungspuf-
fer. Es wurden 25 mg Probe mit der Originalmethode und je 2 g Probe mit der
modifizierten Methode aufgearbeitet. Um sicherzustellen, dass die Sigma-Säulen
nicht überladen wurden, wurden aus dem Überstand nur 0,4 ml entnommen, was
der Menge an Überstand der Originalmethode entspricht. Dabei stellte sich heraus,
dass der Wizard-Magnetic-Kit-Puffer die Gewebezellen nicht effizient aufbrach
und sehr schwierig zu pipettieren war. Die weitere Evaluierung des Puffers wurde
an dieser Stelle eingestellt. Die anderen Extrakte wurden mithilfe des Internal Posi-
tive Control Kits und einem für die jeweilige Spezies spezifischen Primersatz auf
Inhibition untersucht. Mit der Originalmethode wurde mit den Huhn-Primern ein
durchschnittlicher C t -Wert von 21,3, mit dem FISH-Puffer ein C t -Wert von 19,7 und
mit dem CTAB-Proteinase-K-Puffer ein C t -Wert von 18,7 erzielt.
Demnach kann durch den Einsatz des CTAB-Proteinase-K-Puffers, statt dem
Originalpuffer, der Sigma Kit hinsichtlich der DNA-Qualität und der Probenmenge,
die eingesetzt werden kann, optimiert werden.
In einer Arbeit von Binke et al. [12] wurden kommerzielle DNA-Extraktions-
methoden, die CTAB-Extraktion und die Triton-Methode, miteinander verglichen.
Das Ergebnis der Arbeit zeigte, dass die CTAB-Extraktion mit vorhergehendem
Proteinase-K-Verdau eine sehr hohe DNA-Ausbeute mit einem guten Reinheitsgrad
(OD 260 /OD 280 ) von 1,83 ergab.