Extraktion von DNA - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 28

den Kits der Firma Hybaid und Biogene und dem Wizard DNA Clean-Up Kit nach
Angaben des Herstellers zur Anwendung.
Die Extraktion von DNA aus Truthahn, Huhn, Schwein und Rindermuskelge-
webe erfolgte nach den Angaben der Hersteller. Abweichend von diesen Angaben
wurde die DNA nach Isolierung mithilfe des Kits der Firma Sigma in 100 µl Puffer
eluiert. Die Qualität und Menge der isolierten DNA wurde spektrophotometrisch,
gelelektrophoretisch und mittels Taqman-PCR ermittelt. Die spektrophotometrische
Analyse gibt Hinweise auf die Menge und die Qualität der DNA. Die gelbasierte
Analyse erlaubt eine Einschätzung des Fragmentierungsgrades der isolierten DNA.
Das Taqman Internal Positive Control Kit erlaubt eine Bewertung der Amplifika-
tionseffizienz, die bei gleichbleibenden anderen Parametern eine Kenngröße für die
Anwesenheit von PCR-Inhibitoren im DNA-Extrakt darstellt.

3.3.1.2 DNA-Ausbeute und Reinheit

Der Wizard DNA Clean-Up Kit lieferte, unter den gegebenen Bedingungen, die
höchste Ausbeute an DNA für Schwein und Rind. Das Genomic DNA Kit der Firma
Biogene lieferte die höchste Konzentration für Truthahn und Huhn (Abb. 3.1 ).
Nach Überprüfung der Reinheit der Extrakte mithilfe des A 260/280 -Quotienten,
konnte festgestellt werden, dass das Wizard DNA Clean-Up Kit für Rind, das Hybaid
Kit für Schwein und das Sigma Kit für Truthahn und Huhn am besten geeignet ist
(Abb. 3.2 ). Keiner der Extrakte lieferte einen Quotienten von ca. 1,8, weshalb eine
Verunreinigung der Extrakte mit Proteinen als sehr wahrscheinlich anzunehmen ist.
Mithilfe des Magnetic-DNA-Purification-Systems der Firma Promega konnte
aus Schwein und Rind keine DNA isoliert werden, was unter Umständen an einem
fehlerhaften Kit lag.

Inhibitoren Bei der Analyse auf Anwesenheit von Inhibitoren wurde eine definierte
Zahl von DNA-Sequenzen, die keine Relation zur Matrix-DNA haben, mithilfe des
Taqman Internal Positive Control Kits amplifiziert. Hierbei wird bei Abwesenheit
von Inhibitoren ein C t -Wert zwischen 29 und 30 erwartet. Höhere Werte oder flache
Amplifikationskurven lassen auf eine Inhibition der PCR schließen.
Keiner der Rinder-DNA-Extrakte enthielt, nach unseren Untersuchungen mit
dem Internal Positive Control Kit, PCR-Inhibitoren (Tab. 3.1 ). DNA-Extrakte aus
Schwein, die mithilfe des Forensic DNA Kits und des Wizard-DNA-Clean-Up-Sys-
tems isoliert wurden, zeigten starke Inhibitionen, die eine Amplifikation der Posi-
tivkontrolle nicht zuließen. Extrakte, die mithilfe des Wizard-Magnetic-DNA-Pu-
rification-Systems und des DNA Clean-Up Kits isoliert wurden, zeigten ebenfalls
eine starke Inhibition. Gleiches gilt auch für Extrakte aus Truthahn, die mithilfe des
Hybaid Kits isoliert wurden.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Rinder-DNA, unabhängig davon,
mit welchem Kit sie isoliert wurde, konsistent gute Ergebnisse lieferte, die Ergeb-
nisse für DNA aus Schwein, Truthahn und Huhn jedoch je nach verwendetem Kit
zwischen C t -Werten von 27-40 (40 = komplette Inhibition) stark schwankten.