Quantitative Analysen - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 262

wir zertifiziertes Referenzmaterial mit tiefen bis sehr tiefen Analytgehalten (0,1
bis 0,01 %). Zurzeit stehen jedoch für die GVO-Analytik nur zertifizierte Refe-
renzmaterialien mit minimalen Gehalten von 0,1 % GVO zur Verfügung. Alle pu-
blizierten auf real-time PCR basierenden GVO-Nachweisverfahren können einen
GVO-Gehalt von 0,1 % mit einem akzeptablen Maß an Präzision und Richtigkeit
bestimmen.
Die Bestimmungs- und Nachweisgrenze des molekularbiologischen Teils eines
Nachweisverfahrens kann separat mittels verdünnten DNA-Lösungen experimen-
tell bestimmt werden. Es ist aber wichtig, in diesem Zusammenhang darauf hin-
zuweisen, dass dies keinesfalls die Grenzen des Gesamtverfahrens widerspiegelt!
Die Bestimmungsgrenze für den PCR-Teil des Nachweisverfahrens liegt in Über-
einstimmung mit unseren theoretischen Überlegungen bei 30 bis 50 Genkopien,
während die Nachweisgrenze bei 10 bis 20 Genkopien liegt [ 5 ].
14.3 Analytisches Vorgehen
14.3.1 Real-Time PCR
Bei der real-time PCR werden dem PCR-Ansatz eine oder mehrere für die Zielse-
quenz oder Zielsequenzen spezifische Sonde(n) zugesetzt, die mit Fluoreszenzfarb-
stoffen markiert sind. Diese Sonden fluoreszieren durch entsprechende externe An-
regung (Excitation) nach Bindung an die Zielsequenz, entweder nach enzymatischer
Hydrolyse von Quenchermolekülen (z. B. TaqMan-Sonden) durch Taq-DNA-Poly-
merase oder durch Energietransfer zwischen Sonden, die in unmittelbarer Nach-
barschaft an die Zielsequenz hybridisieren (FRET-Sonden). Dabei steigt in jedem
Zyklus die Fluoreszenz proportional zur Anzahl synthetisierter PCR-Produkte.
Das während der PCR erzeugte Fluoreszenzsignal wird mithilfe eines optischen
Systems in Echtzeit (real time) gemessen. Die Software des Real-Time-PCR-Ge-
rätes stellt die gemessene relative Fluoreszenz in Echtzeit nach jedem Zyklus dar.
Die Auswertung beruht im Gegensatz zur klassischen PCR-Analytik nicht auf einer
Bestimmung der PCR-Produkte am Ende der PCR, sondern auf einer kinetischen
Messung der Zunahme von Fluoreszenz während der PCR infolge der Bildung von
spezifischen Amplifikationsprodukten. Die Quantifizierung der Zielsequenzen in
der Proben-DNA erfolgt schließlich über externe Standardreihen mit bekannten
Konzentrationen von Zielsequenzen. In jeder quantitativen Analysenreihe müssen
deshalb neben den in den spezifischen SOPs beschriebenen Kontrollen Standards
zur Quantifizierung mitgeführt werden.
Die Auswertungssoftware berechnet aus den Schnittpunkten der Fluoreszenz-
kurven der Proben mit einem vom System oder vom Analytiker festgesetzten
Schwellenwert (threshold value) die jeweiligen C t -Werte. Die Kalibrationsgerade
wird in der Regel als Regressionsgerade in der semilogarithmischen Darstellung
der DNA-Menge (Anzahl Genomkopien) versus C t -Wert für jeden PCR-Lauf be-