Molekulare Methoden zum Nachweis, zur Quantifizierung und zum Monitoring der Mykotoxinbildung lebensmittelrelevanter Pilze - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 212

nor -1 ( afl D)-Gen der Aflatoxinbiosynthese. Mithilfe dieser PCR-Reaktion konnte
die Expression des nor -1-Gens in Weizenproben verfolgt werden. Ein vergleichba-
res System wurde für P. nordicum , einer Ochratoxin-A-bildenden Penicillium- Spe-
zies, beschrieben (Geisen et al., 2004 ). Dieses System basiert auf dem otapks PN-
Gen, das für die Ochratoxin-A-Polyketidsynthase kodiert. Auch hier konnte gezeigt
werden, dass die Expression dieses Gens mit der Ochratoxinbildung korreliert. RNA
wurde direkt aus Weizenmaterial isoliert und in die Reaktion eingesetzt. Auch mit
diesem System konnte die Aktivierung der Expression vor der Bildung größerer
Mengen an Ochratoxin A gemessen werden. O'Callaghan et al. ( 2006 ) zeigten, dass
verschiedene Umweltfaktoren und Bestandteile des Substrates die Expression des
Ochratoxin-Polyketidsynthasegens von A. ochraceus stark beeinflussen können.
Die höchste Bildung von Ochratoxin A sowie die höchste Expression des pks- Gens
konnte bei sauren pH-Werten nachgewiesen werden. Häufig führen Stressreak-
tionen, die durch für den Pilz ungünstige Kombinationen an äußeren Parametern
hervorgerufen werden, zu einer Aktivierung der mykotoxinbiosynthetischen Gene
(Schmidt-Heydt et al., 2008 ; Jurado et al., 2008 ).
Eine Korrelation der Expression mykotoxinbiosynthetischer Gene mit der My-
kotoxinbildung ist nicht in allen Fällen gegeben. Nur die Expression bestimm-
ter Schlüsselgene ist direkt mit der Mykotoxinbildung gekoppelt. Daher müssen
bei einem solchen Ansatz diese Schlüsselgene identifiziert werden. Scherm et al.
( 2005 ) untersuchten zu diesem Zweck verschiedene Gene des Aflatoxinbiosynthe-
seclusters. Sie konnten drei Gene identifizieren, deren Expression mit der Afla-
toxinbildung gekoppelt war. Es handelte sich um nor -1, omt A und omt B ( afl D,
afl P, afl O). In einer anderen Arbeit wurde für die ochratoxinbiosynthetischen Gene
gezeigt, dass nur die Expression des otspks PV-Gens direkt mit der Ochratoxinbil-
dung gekoppelt ist, während alle anderen Gene eine wesentlich weniger stringente
Assoziation zeigen (Geisen et al., 2006 ). Diese Tatsachen müssen bei der Etablie-
rung eines Genmonitoringsystems, das auf einem Zielgen beruht, bedacht werden.
Bei Verwendung von Microarrays zur Genexpressionsanalyse besteht dieses Prob-
lem nicht. Mithilfe des Microarrays kann der gesamte Biosyntheseweg gleichzeitig
analysiert werden, wodurch Unterschiede in den Expressionsstärken der einzelnen
Gene ausgeglichen werden. Bei der Anwendung eines Microarrays ist zu erwarten,
dass ein bestimmtes Expressionsmuster eine aktive Mykotoxinbiosynthese anzeigt.
Kürzlich wurde ein Microarray (MycoChip) beschrieben, der für die praktische
Anwendung zum Monitoring der Aktivierung mykotoxinbiosynthetischer Genclus-
ter geeignet ist (Schmidt-Heydt u. Geisen, 2007b ). Dieser Microarray enthält die
Gencluster der Aflatoxin-, Trichothecen-, Fumonisin- und Ochratoxinbiosynthe-
se und ist somit für die wichtigsten lebensmittelrelevanten Mykotoxine anwend-
bar. Ein typisches Ergebnis einer Expressionsanalyse mit diesem Microarray ist in
Abb. 12.3 gezeigt.
Der MycoChip ist sehr gut geeignet zur Erstellung von Expressionskinetiken
(Schmidt-Heydt u. Geisen, 2007a ), zur Ermittlung der Wachstumsparameter, die
eine Aktivierung der Gene fördern bzw. unterdrücken (Schmidt-Heydt u. Geisen,
2007a ) sowie zum direkten Nachweis der Aktivierung eines Mykotoxinbiosynthe-