Chemistry Reference
In-Depth Information
10.4.2.2
Qualitätssicherung
Allgemein
Die Anforderungen an die Durchführung und Auswertung von PCR-Untersuchun-
gen zum Nachweis gentechnischer Veränderungen sind in internationalen Normen
beschrieben [
8
,
23
]. Dazu zählen allgemeine Anforderungen an die Labororganisa-
tion (Einbahnstraßenprinzip), Untersuchungsschritte in mindestens drei separaten
Arbeitsbereichen: Extraktion/PCR-Setup/post-PCR und instrumentelle und perso-
nelle Anforderungen (z. B. Laborkleidung). Ergebnisse beruhen auf der Untersu-
chung zweier separater Analysenproben, beginnend bei der Einwaage [
8
].
Kontrollen
Weiterhin sind in jeder PCR Kontrollen mitzuführen: Positivkontrollen (z. B. geno-
mische oder Plasmid-DNA mit der nachzuweisenden Sequenz) werden zur Sicher-
stellung der Sensitivität des Nachweises in möglichst niedrigen Konzentrationen
eingesetzt. Amplifikationskontrollen der Proben-DNA, in der Regel über einen se-
paraten PCR-Nachweis spezies-spezifischer Sequenzen (s. auch Abb.
10.5
, links),
dienen der Überprüfung der Eignung der extrahierten DNA für die weitere Analy-
tik. Für eine Inhibitionskontrolle wird die Proben-DNA in unterschiedlichen (min-
destens zwei) Konzentrationen auf mögliche Inhibitionen überprüft. Alternativ oder
zusätzlich kann sie mit DNA der nachzuweisenden Sequenz oder einer internen
Positivkontrolle „gespickt“ werden. Unerlässliche Negativkontrollen sind Extrak-
tionskontrollen (Extraktionsleerwert anstelle von Proben-DNA) und die PCR-Rea-
genzienkontrolle (Wasser anstelle von Proben-DNA) [
8
].
Auswertung
Entsprechend den Vorgaben [
23
] sind erhaltene Amplifikate, zusätzlich zum Ver-
gleich ihrer Fragmentlänge mit der Positivkontrolle im Agarosegel, zu verifizieren.
Dazu kann einen Sondenhybridisierung, eine Restriktionsanalyse oder eine Sequen-
zierung herangezogen werden. Diese teilweise recht aufwendige Bestätigung ist bei
Verwendung von Real-Time-PCR-Verfahren nicht erforderlich, da die dort zusätz-
lich benötigten fluoreszenzmarkierten Sonden den entsprechenden Spezifitätsge-
winn des Nachweises mit sich bringen.
10.4.2.3
Semiquantitative Analytik mittels kompetitiver PCR
Besonders vor der Verbreitung der real-time PCR wurde als Endpunkt-PCR-Verfah-
ren die kompetitive PCR zur semiquantitativen Abschätzung des Anteils gentech-
nischer Veränderungen eingesetzt [
28
]. Als Kompetitor wird in der Regel Plasmid-
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