Molekularbiologische Speziesdifferenzierung - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 130

vermutet, so ist die Auswertung der Restriktionslängenpolymorphismen die Metho-
de der Wahl.
Mit einem universellen Primer-System lassen sich prinzipiell alle Tierarten
nachweisen. Die Reaktionsbedingungen der PCR werden dabei nicht auf ma-
ximale Spezifität optimiert. Einige Arten weisen Punktmutationen im Bereich
der Primer-Bindungsstellen auf; die Reaktionsbedingungen der PCR müssen so
gewählt werden, dass trotz solch suboptimaler Matchings der Primer eine PCR
ablaufen kann. Liegen Gemische mit mehreren Arten vor, kommt es aufgrund
der unterschiedlichen Hybridisierungseffizienz der Primer bei den verschiedenen
Spezies zur bevorzugten Amplifikation einer Art im Vergleich zu den weiteren
Arten. Diese unterschiedlichen PCR-Effizienzen können dazu führen, dass ge-
ringe, jedoch lebensmittelhygienisch relevante Anteile einer Spezies in einem
aus Fleisch einer anderen Spezies nicht detektiert werden. So werden Anteile
von weniger als 10 % Geflügelfleisch in Schweinefleisch bei Amplifikation mit
den universellen Cytochrom-b-Primern nicht erkannt. Dies macht Adaption der
Primer an die Zielspezies oder eine Gruppe von Arten erforderlich. Die adap-
tierten Primer sind nach wie vor universell, sie hybridisieren jedoch an DNA der
Tierarten, an deren Sequenz sie adaptiert wurden, mit deutlich höherer Effizienz
(Abb. 9.2 ).
Zur Differenzierung der PCR-Produkte mit Restriktionsendonukleasen ist es er-
forderlich, mindestens zwei Enzyme anzuwenden, da durch eine spontane Punkt-
mutation eine Restriktionsschnittstelle verändert werden kann. Die Wahrscheinlich-
keit, dass zwei Schnittstellen vom gegebenen Muster abweichen, ist hingegen sehr
gering. Es ist bei der Auswertung zu beachten, dass einige Tierarten wie Schaf und
Hund aufgrund von rassespezifischen Unterschieden auch bei einigen Enzymen ab-
weichende Bandenmuster aufweisen.
Abb. 9.2 Restriktions-
analyse der Geflügeladap-
tierten Mel1/2 PCR zum
Nachweis von Huhn und
Pute in Fleischerzeugnissen.
Rsa I schneidet Huhn und
Pute, Pst I schneidet lediglich
Pute. Probe 1: Erzeugnis
aus Hühnerfleisch; Probe 2:
Erzeugnis aus Putenfleisch