Zusammenfassung und Ausblick - Protein-Microarrays fur die Wirkstoffentwicklung - page 63

anreichern. Dies konnte sowohl im Coomassie-gefärbten SDS-Gel wie auch
im Western Blot mit einem Antikörper (Anti-His-Tag) nachgewiesen werden.
Im zweiten Teil der Arbeit konnte ein direkt-kompetitiver Verdrängungs-
assay mit dem hergestellten HtpG aus H. pylori und dem von PD D R . C ARSTEN
Z EILINGER Institut für Biophysik, Leibniz Universität Hannover produzierten
humanen Hsp90α entwickelt werden. Es wurde auf einen am Institut vorhan-
den Standard-kompetitiven Assay zum Screenen von Inhibitoren am humanen
Hsp90α Protein zurückgegriffen und dieser angepasst. Verändert wurde, das
nicht FITC-GA aus der ATP-Bindungs- tasche der Hitzeschockproteine ver-
drängt wurde, sondern Cy3-markiertes ATP, da Geldanamycin nicht an das
bakterielle HtpG bindet. Außerdem lässt sich somit der Assay schneller auf
andere Hitzeschockproteine, die alle ATP als natürlichen Liganden haben,
übertragen. Der größte Vorteil von Cy3-ATP ist, dass es der natürliche Ligand
der Proteine ist und somit viel sensitiver für die ATP-Bindetasche ist. Deswei-
teren ist der Cy3 Farbstoff stabiler als FITC und zerfällt nicht so schnell.
Es konnten beide Proteine nebeneinander auf der Nitrozellulose-memb-
ran eines 16-Pad-Chips immobilisiert werden, ohne dass ihre ATP-Bindungs-
eigenschaften verloren gingen. Nachdem Cy3-ATP erfolgreich an die Proteine
gebunden werden konnte, wurden andere Inhibitoren getestet, die gleichzeitig
mit dem Cy3-ATP zu den immobilisierten Proteinen gegeben und über Nacht
inkubiert wurden. Die direkte Kompetition zwischen dem ATP und den Inhi-
bitoren ist neu im Vergleich zum vorherigen Assay. Durch die Kompetition
sollen die Hydrolyse des ATP verringert werden. Desweiteren wurde der As-
say von drei auf zwei Tage verkürzt und ist somit zeit- und kostensparender.
Es wurden die potentiellen Inhibitoren 17AAG, Radicicol, SEB01,
SEB07, SEB13, SEB43, SEB44, SEB51, SE239 und SEF17 mit dem direkt-
kompetitiven Verdrängungsassay getestet. Die potentiellen Inhibitoren wur-
den im Arbeitskreis von P ROF . D R . A NDREAS K IRSCHNING , Institut für Orga-
nische Chemie, Leibniz Universität Hannover durch Mutasynthese hergestellt.
Der Assay lieferte gute Ergebnisse und die ermittelten Z-Faktoren lagen alle
im exzellenten Bereich. Somit waren die Qualität und die Aussagekraft des
Assays sehr hoch. Es konnten sowohl gute als auch schlechter bindene Inhibi-
toren identifiziert werden. Ein sehr guter Inhibitor war SEB01, gefolgt von
SEB13, Radicicol und SEB44 für beide Proteine. Nicht bindende Inhibitoren