Zusammenfassung und Ausblick - Protein-Microarrays fur die Wirkstoffentwicklung - page 62

4 Zusammenfassung und Ausblick
Ziel der Arbeit war es ein bakterielles Hitzeschockprotein herzustellen und zu
charakterisieren. Die Bindungseigenschaften der ATP-Bindetasche der C-ter-
min-alen Domäne des HtpG aus H. pylori sollten auf potentielle Inhibitoren
im Protein-Microarray-Format untersucht werden, um anschließend diese mit
den des humanen Hsp90α zu vergleichen.
Während der Masterarbeit konnte das bakterielle Hitzeschockprotein
HtpG aus H. pylori der Hsp90-Familie erfolgreich hergestellt werden, um an-
schließend Protein-Microarray Experimente durchzuführen. Im ersten Teil der
Arbeit konnte das htpg Gen mittels Touchdown-PCR amplifiziert werden und
daraufhin erfolgreich in den pET SUMO Expressionsvektor kloniert werden.
Nach der Sequenzierung wurde die DNA Sequenz der N-terminalen Domäne
mit dem Computerprogramm CLC Sequence Viewer in die Aminosäurese-
quenz übersetzt und festgestellt, dass sie sich in fünf Aminosäuren im Ver-
gleich zum HtpG aus H. pylori , Stamm 210 unterschiedet. Die wichtigen Ami-
nosäuren für die Bindung des Liganden in der ATP-Bindetasche sind nicht
betroffen und die Hydrophatie in der Bindungstasche hat sich nur maginal ver-
ändert. Es könnte sein, dass während den molekularbiologischen Arbeiten mit
der DNA Punktmutationen besonders am 5'-Ende entstanden sind. Es konnte
innerhalb dieser Masterarbeit nicht geklärt werden, welche Auswirkungen
diese auf die Funktionalität des Proteins haben. Die ATP-Bindestelle liegt am
N-terminalen Ende des Proteins. Es wurde angenommen, dass die Mutationen
keinen großen Einfluss auf die Funktionalität der ATPase Aktivität haben. Um
die Punktmutationen zu entfernen, müssten passende Primer entwickelt wer-
den und erneut mehrere Male eine PCR durchgeführt werden. Das Klonie-
rungsprodukt wurde in kompetente BL21 E. coli Zellen transformiert und in
LB-Medium kultiviert. Die Induktion der Proteinexpression erfolgte durch
ITPG bei 16 °C und über Nacht. Nach dem Ernten der Zellen und dem Zell-
aufschluss mit einer Frech Press wurde das HtpG mit einer Affininitätchroma-
tographie (IMAC) gereinigt. Das Protein ließ sich deutlich aufreinigen und