Alternative Nachweisverfahren –nicht PCR-basierende Schnellmethoden - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 71

6.4 Nucleinsäurebasierende Verfahren

Gensonden ermöglichen es, gesuchte Zielkeime aus Lebensmitteln zu identifizieren
und dabei auf eine Kultivierung zu verzichten (Schmid et al. 2005 , Amann et al.
1996 , Ercolini et al. 2006b , Nordstrom et al. 2006 , Bottari et al. 2006 ). Charakteristi-
sche Genomabschnitte reichen aus, um mit entsprechenden Oligonucleotidsequenzen
brauchbare Gensonden herzustellen. Der Einsatz von Gensonden ist besonders bei
langsam wachsenden und schwer zu kultivierenden Bakterien erfolgversprechend.
Ein gebräuchliches Verfahren ist die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (Moter
und Gobel 2000 ). Dabei wird die bakterielle DNA der Zielorganismen in situ (d. h.
in der Bakterienzelle) mit Fluoreszenzfarbstoff-markierten Sonden hybridisiert und
direkt im Mikroskop identifiziert (Abb. 6.1 ). Je nach gewähltem Design lassen sich
mehrere Sonden gleichzeitig einsetzen. Dabei können nicht nur spezifische bakteriel-
le Genera und Spezies dargestellt, sondern diese auch in ihrer Lage zueinander oder
in Bezug auf die umgebende Lebensmittelmatrix identifiziert werden (Amann et al.
1995 ). Die Vorteile der Technik sind die einfache Handhabung, die direkt-optische
mikroskopische Kontrolle und die Möglichkeit, Sonden so einzusetzen, dass nur le-
bende d. h. vermehrungsfähige Keime dargestellt werden (Poulsen et al. 1993 ). Bei-
spielsweise werden zusätzlich RNA-Fragmente detektiert, deren Vorliegen auf die
Lebensfähigkeit der Isolate hinweist. Die Gensonden sind methodenspezifisch mit
einer geeigneten Markierung versehen. Dann setzt man fluoreszenzmarkierte Gen-
sonden ein, die mit ribosomalen Nukleotidsequenzen des Zielbakteriums hybridisie-
ren (Becker und Märtlbauer 2002 ). Nachteile der FISH-Methodik sind die notwendige
Beherrschung mikroskopischer Arbeitstechniken, die erschwerte Quantifizierbarkeit
und die schlechte Automatisierbarkeit. Außerdem sind Störungen der Hybridisierung
nicht ausgeschlossen, vermutlich ausgelöst durch Lebensmittelbestandteile.
Ortsungebundene Hybridisierungssysteme zum Nachweis von pathogenen Mik-
roorganismen wurden von verschiedenen akademischen und industriellen Arbeits-

Abb. 6.1 Nachweis von
Salmonella spp. mit der
Sonde Salm-63. (Kutter
et al. 2006 ; Aufnahme: M.
Schmid, GSF München und
M. Wagner, Veterinärmedi-
zinische Universität Wien)