PCR und Real-Time PCR - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 41

nellen PCR-Assays haben den Nachteil, dass sie sehr aufwändig und zeitintensiv
sind und damit für die Routinediagnostik wenig geeignet.
Ein großer Fortschritt zur Quantifizierung von DNA ist die Real Time-fluores-
zenzbasierte-PCR. Sie basiert auf der Grundlage, dass ein quantitativer Zusam-
menhang zwischen der Ausgangsmenge an Zielnukleinsäure und dem während der
exponentiellen Phase gebildeten PCR-Produkts besteht, da bei jedem Zyklus die
DNA-Menge verdoppelt wird [ 18 ].
Eine Hydrolyse der Sonde kann nur dann erfolgen, wenn es zu einer sequenzspe-
zifischen Hybridisierung zwischen Sonde und Zielsequenz kommt. Entsprechend
der Amplifikation des spezifischen PCR-Fragmentes steigt das Fluoreszenzsignal
an. Dabei ist die Fluoreszenzzunahme mit dem Zuwachs an PCR-Amplifikat direkt
proportional. Die Auswertung der Analyse erfolgt über den sogenannten C t -Wert
(„threshold cycle“) oder Cp („crossing point“). Der C t -Wert drückt die Zyklenzahl
aus, bei der zum ersten Mal ein Anstieg der Reporterfluoreszenz über das Grundrau-
schen ermittelt wird (Abb. 4.1 ). Beim C t -Wert übersteigt die Standardabweichung
der Fluoreszenzwerte die des Grundrauschens um den Faktor 10 [ 6 ].
Der C t -Wert ist abhängig von der Anzahl an Template-Kopien, der Reaktions-
effizienz, der Effizienz der Spaltung oder Hybridisierung der Sonden und der
Sensitivität der Detektion. Je weniger Zyklen benötigt werden, um diesen Punkt
zu erreichen, desto höher war die Kopiezahl der Ziel-DNA im Ausgangsmaterial.
Nichtsdestotrotz müssen Standardreihen (z. B. Plasmid-DNA mit dem klonierten
PCR-Produkt) zur Quantifizierung der PCR-Produkte in jedem Lauf mitgeführt
werden, um die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Daten zu gewährleis-
ten (Abb. 4.2 ).

Probe

Threshold

R n

Grundrauschen

Negativkontrolle

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Zyklen

C t -Wert

Abb. 4.1 Ermittlung des C t -Wertes